目的基因的名詞解釋_制備方法_制備流程
目的基因的名詞解釋
把需要研究的基因稱為目的基因。(一般把需要分析的基因稱靶基因，在基因克隆過程中有時兩者均稱為插入基因，有時三者含義相近。所以有時有些書本上也籠統(tǒng)的稱“用限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因(靶基因)”)。
目的基因的制備方法
從細胞核中直接分離
簡單的原核生物目的基因可從擬核中直接分離得到，但人類的基因分布在23對染色體上，較難從直接法中得到。
直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。這種方法有如用獵槍發(fā)射的散彈打鳥，無論哪一顆彈粒擊中目標(biāo)，都能把鳥打下來。鳥槍法的具體做法是：用限制酶(即限制性內(nèi)切酶)將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分別在受體細胞中大量復(fù)制(在遺傳學(xué)中叫做擴增)，從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲，抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。
用“鳥槍法”獲取目的基因的優(yōu)點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性。
染色體DNA的限制性內(nèi)切酶酶解
II型限制性內(nèi)切酶可專一性地識別并切割特定的DNA順序，產(chǎn)生不同類型的DNA末端。若載體DNA與插入的DNA片段用同一種內(nèi)切酶消化，或靶DNA與載體DNA末端具有互補的粘性末端，可以直接進行連接。
DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端。當(dāng)限制酶在識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是黏性末端，而當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產(chǎn)生的則是平末端。
人工體外合成
簡短的目的基因可在了解DNA一級結(jié)構(gòu)或多肽鏈一級結(jié)構(gòu)氨基酸編碼的核苷酸序列的基礎(chǔ)上人工合成。
用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA
大多數(shù)的目的基因是由mRNA合成cDNA(反轉(zhuǎn)錄DNA)得到。從RNA入手，先從細胞提取總RNA，然后根據(jù)大多數(shù)真核mRNA含有多聚腺嘌呤(polyadenylic acid ,polyA)尾的特點，用寡聚dT纖維素柱將mRNA分離出，以mRNA為模板，在多聚A尾上結(jié)合12-18個dT的寡聚dT片段，作為合適的起始引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第一條。
從基因文庫中獲取
依據(jù)：基因的核苷酸序列，功能，在染色體中的位置，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的性質(zhì)。
PCR技術(shù)擴增
PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，由穆里斯等人于1988年發(fā)明的，1993年獲諾貝爾獎。PCR是一種在生物體外迅速擴增DNA片斷的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份DNA拷貝。這項技術(shù)解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題，被廣泛地應(yīng)用于遺傳疾病的疹斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等方面。PCR的原理是DNA雙鏈復(fù)制的原理，將基因的核苷酸不斷地加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)增長。利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物(2種)。擴增的過程是：目的基因DNA受熱變性后解旋為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下進行延伸，如此重復(fù)循環(huán)多次。
目的基因的制備流程
cDNA鏈，用堿或RNA酶水解除去mRNA，再用DNA聚合酶，最好是Klenow片段合成第二條DNA鏈。雙鏈合成后，用S1核酸酶切去發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即可獲得雙鏈cDNA。cDNA用于探針制備、序列分析、基因表達等研究。因此以cDNA為研究材料，反映了mRNA的轉(zhuǎn)錄及對以后翻譯的影響情況，即反映某一基因(DNA)外顯子的情況。
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