重組dna技術(shù)的名詞解釋_操作步驟_產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀
重組dna技術(shù)的名詞解釋
基因工程(genetic engineering)又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。
重組dna技術(shù)的操作步驟
工具
(1)酶：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、
(2)載體：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、Ti質(zhì)粒、人工染色體
1.提取目的基因
獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步。如植物的抗病(抗病毒 抗細(xì)菌)基因，種子的貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因干擾素基因等，都是目的基因。
要從浩瀚的“基因海洋”中獲得特定的目的基因，是十分不易的?？茖W(xué)家們經(jīng)過不懈地探索，想出了許多辦法，其中主要有兩條途徑：一條是從供體細(xì)胞的DNA中直接分離基因;另一條是人工合成基因。
直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制(在遺傳學(xué)中叫做擴(kuò)增，如使用PCR技術(shù))，從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。
用鳥槍法獲得目的基因的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，缺點(diǎn)是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核細(xì)胞的基因含有不表達(dá)的DNA片段，一般使用人工合成的方法。
人工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，推測(cè)出它的基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得。
2.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合
基因表達(dá)載體的構(gòu)建(即目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)是實(shí)施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
將目的基因與運(yùn)載體結(jié)合的過程，實(shí)際上是不同來源的DNA重新組合的過程。如果以質(zhì)粒作為運(yùn)載體，首先要用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使質(zhì)粒出現(xiàn)一個(gè)缺口，露出黏性末端。然后用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端(部分限制性內(nèi)切酶可切割出平末端，擁有相同效果)。將切下的目的基因的片段插入質(zhì)粒的切口處，首先堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，兩個(gè)黏性末端吻合在一起，堿基之間形成氫鍵，再加入適量DNA連接酶，催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連接起來，形成一個(gè)重組DNA分子。如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA分子結(jié)合，形成重組DNA分子(也叫重組質(zhì)粒)的。
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞是實(shí)施基因工程的第三步。目的基因的片段與運(yùn)載體在生物體外連接形成重組DNA分子后，下一步是將重組DNA分子引入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。
基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌，枯草桿菌，土壤農(nóng)桿菌，酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。
用人工方法使體外重組的DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，主要是借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。例如，如果運(yùn)載體是質(zhì)粒，受體細(xì)胞是細(xì)菌，一般是將細(xì)菌用氯化鈣處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，就可以隨著受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌的繁殖速度非常快，在很短的時(shí)間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因。
4.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)
目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測(cè)與鑒定才能知道。這是基因工程的第四步工作。
以上步驟完成后，在全部的受體細(xì)胞中，真正能夠攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞是很少的。因此，必須通過一定的手段對(duì)受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)的方法有很多種，例如，大腸桿菌的某種質(zhì)粒具有青霉素抗性基因，當(dāng)這種質(zhì)粒與外源DNA組合在一起形成重組質(zhì)粒，并被轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，就可以根據(jù)受體細(xì)胞是否具有青霉素抗性來判斷受體細(xì)胞是否獲得了目的基因。重組DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞后，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)過程。
重組dna技術(shù)的產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀
1989年，中國(guó)批準(zhǔn)了第一個(gè)在中國(guó)生產(chǎn)的基因工程藥物——重組人干擾素αlb，標(biāo)志著中國(guó)生產(chǎn)的基因工程藥物實(shí)現(xiàn)了零的突破。重組人干擾素αlb是世界上第一個(gè)采用中國(guó)人基因克隆和表達(dá)的基因工程藥物，也是到目前為止唯一的一個(gè)中國(guó)自主研制成功的擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因工程一類新藥。從此以后，中國(guó)基因工程制藥產(chǎn)業(yè)從無到有，不斷發(fā)展壯大。1998年，中國(guó)基因工程制藥產(chǎn)業(yè)銷售額已達(dá)到了7.2億元人民幣。截止1998年底，中國(guó)已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物和疫苗產(chǎn)品共計(jì)15種。國(guó)內(nèi)已有30余家生物制藥企業(yè)取得了基因工程藥物或疫苗試生產(chǎn)或正式生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)。
根據(jù)1997年對(duì)全國(guó)452從個(gè)事生物技術(shù)研究、開發(fā)和生產(chǎn)的單位進(jìn)行的通訊調(diào)查結(jié)果，截止1996年底，中國(guó)已有8種基因工程藥物和疫苗商品化(包括試生產(chǎn))，1996年基因工程藥物和疫苗銷售額約為2.2億元人民幣，僅占同期全國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品年銷售額21.16億元人民的10.4%。然而可喜的是，中國(guó)基因工程制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，年銷售額已從1996年的2.2億元人民幣增長(zhǎng)到1998年的7.2億元人民幣，年均增長(zhǎng)率高達(dá)80%。預(yù)計(jì)2000年中國(guó)基因工程藥物銷售額將達(dá)到22.8億元人民幣。
基因工程在制藥業(yè)中具有廣闊的發(fā)展前景，中國(guó)的基因制藥行業(yè)已經(jīng)初具規(guī)模，但與世界發(fā)達(dá)國(guó)家存在差距，主要表現(xiàn)在具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品較少，產(chǎn)業(yè)規(guī)模小、經(jīng)濟(jì)效益低?；蛑扑幃a(chǎn)業(yè)面臨著歷史性的機(jī)遇，主要表現(xiàn)在政府支持、資源豐富、基因信息公開、國(guó)際交流增加等方面。提高自主開發(fā)能力、保護(hù)基因資源是當(dāng)前亟待解決的問題，同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)基因制藥領(lǐng)域技術(shù)壁壘的研究與準(zhǔn)備。
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