什么是單克隆抗體介紹
因單一克隆B細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的，只識別抗原分子某一特定決定簇的特異性抗體。那么你對單克隆抗體了解多少呢?以下是由學(xué)習(xí)啦小編整理關(guān)于什么是單克隆抗體的內(nèi)容，希望大家喜歡!
什么是單克隆抗體
單克隆抗體由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤(hybridoma)抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B細(xì)胞雜交瘤。用具備這種特性的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)成細(xì)胞群，可制備針對一種抗原表位的特異性抗體即單克隆抗體。
單克隆抗體制備過程
1、免疫動物
免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。
2、細(xì)胞融合
采用二氧化碳?xì)怏w處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。
3、選擇性培養(yǎng)
選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。
4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化
在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存。
5、單克隆抗體的大量制備
單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。
(1)體內(nèi)誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。
(2)體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。
單克隆抗體的鑒定實(shí)驗(yàn)
1.雜交瘤細(xì)胞染色體的檢查采用秋水仙素裂解法進(jìn)行。
2.單克隆抗體的類型、亞型的測定：購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，采用瓊脂擴(kuò)散法或ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型。
3.單抗的特異性鑒定可以采用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等，同時(shí)還需做免疫阻斷試驗(yàn)等。
4.單抗的效價(jià)測定可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價(jià)不同。培養(yǎng)上清液的效價(jià)遠(yuǎn)不如腹水的效價(jià)。采用凝集反應(yīng)，腹水效價(jià)可達(dá)5×104。而采用ELISA檢查，腹水效價(jià)可達(dá)1.0×106。單抗的效價(jià)以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示。
5.必要時(shí)還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定。
一、試劑原理：
本試劑盒利用雙抗體夾心法鑒定小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤培養(yǎng)上清中單克隆抗體或特異親和純化的單克隆抗體的類和亞類(可區(qū)分出IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA)。采用小鼠抗體共有位點(diǎn)的二抗包被微孔板，與加入的培養(yǎng)上清中的小鼠抗體結(jié)合，再加入HRP標(biāo)記的抗小鼠各類、亞類的抗體來分別反應(yīng)，最后用TMB底物系統(tǒng)顯色并用稀硫酸終止，再通過酶標(biāo)儀檢測吸光度來判斷被測單克隆抗體的類或亞類。本試劑盒具有極高的分辨率，是您鑒定小鼠單克隆抗體類、亞類的可靠工具。
二、使用范圍：
用于小鼠單克隆抗體Ig類、亞類的鑒定以及相關(guān)內(nèi)容的研究。
三、使用方法：
1、首先將試劑盒恢復(fù)室溫(大約30分)，然后用純水把清洗液配成工作濃度(一份濃縮清洗液加19份純水)。
2、取出酶標(biāo)板。每個(gè)標(biāo)本需要6孔，陽性對照6孔。多余的用自封袋保存，記得放入干燥劑。
3、將細(xì)胞培養(yǎng)上清(或特異親和純化的抗體)50μl加入酶標(biāo)微孔板，每個(gè)標(biāo)本加6孔，陽性對照也是加6孔每孔50μl。然后每孔再加入50μl標(biāo)本稀釋液。貼上封板膜37℃溫育30分鐘。
4、棄去板內(nèi)液體，洗板5遍后在不掉纖維的吸水材料上拍干或機(jī)洗5遍。再在每個(gè)標(biāo)本的6孔中分別加入6種酶標(biāo)二抗各100μl，通用陽性對照的6孔也一樣。在加樣圖上或酶標(biāo)板上做好標(biāo)記。貼上封板膜37℃溫育30分鐘。
5、吸棄板內(nèi)液體，洗板5遍后在不掉纖維的吸水材料上拍干或機(jī)洗5遍。每孔分別加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，換一張新的封板膜貼板避光37℃顯色20分鐘。
6、本試劑盒特異性好一般肉眼即可觀察出結(jié)果，看顯色藍(lán)的那個(gè)孔所對應(yīng)的酶標(biāo)二抗就知道此標(biāo)本的Ig類或亞類。更可將反應(yīng)終止液(每孔50μl)終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀450nm測定波長，630nm參考波長雙波長測定結(jié)果，參看高值孔所對應(yīng)的酶標(biāo)二抗就知道此標(biāo)本的Ig類或亞類。陽性對照0D小于0.5實(shí)驗(yàn)無效，需要重做。