高中生物單克隆抗體實(shí)驗(yàn)總結(jié)
考試是檢測學(xué)生學(xué)習(xí)效果的重要手段和方法，考前需要做好各方面的知識儲備。下面是學(xué)習(xí)啦小編為大家整理的高中生物單克隆抗體實(shí)驗(yàn)總結(jié)，希望對大家有所幫助!
高中生物單克隆抗體實(shí)驗(yàn)總結(jié)
(一)動物的選擇
目前應(yīng)用最廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好。就品系而言以Balb/c小白鼠應(yīng)用最廣，由于所有的小白鼠骨髓瘤系均從Balb/c小白鼠系誘導(dǎo)出來。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以8~12周齡為宜。
大白鼠也可，能產(chǎn)生較多量的單抗體?，F(xiàn)在已經(jīng)在小鼠雜交瘤的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小鼠-大鼠，小鼠-人以及人-人雜交瘤技術(shù)。
(二)免疫
一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強(qiáng)的抗原。
免疫程序、劑量和方法是關(guān)系到是否能得到所需要的單抗體的關(guān)鍵之一。
正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細(xì)胞，一只純種小白鼠估計(jì)能產(chǎn)生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬分之一的機(jī)會獲得某一種特定抗體。所以為了進(jìn)步得到某種雜交瘤的機(jī)會，必須加強(qiáng)免疫，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增加。
B淋巴細(xì)胞的不同發(fā)育階段對獲得陽性雜交瘤也有很大影響。有人以為處在轉(zhuǎn)化時(shí)期的B淋巴細(xì)胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，固然是抗體產(chǎn)生的高峰時(shí)期，但形成有活力的雜交瘤細(xì)胞的可能反而減少。故一般以為加強(qiáng)免疫后的第三天應(yīng)殺鼠取脾做細(xì)胞融合。
1.可溶性抗原(蛋白質(zhì)) 以1mg/ml～5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點(diǎn)小鼠皮下注射，總量為0.3ml～0.6ml，間隔3～5周再同樣注射一次，10天后，斷尾取血一滴，測抗體效價(jià)，選滴度高的小鼠做融合試驗(yàn)。一個(gè)月后可以經(jīng)靜脈(尾靜脈)給予無佐劑抗原0.2ml～0.4ml，3～4天后，殺死小鼠取脾做融適用。
2.顆粒性抗原 如抗原來源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時(shí)間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以1%濃度每只皮下注射0.2ml，每周2次，共免疫5～8次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人以為最后一次免疫劑量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。
單抗技術(shù)是主要由抗原制備，免疫動物，細(xì)胞融合，篩選雜交瘤細(xì)胞，克隆化培養(yǎng)，單克隆抗體的大量制備與鑒定等一系列實(shí)驗(yàn)組成的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，其核心部分是細(xì)胞融合。細(xì)胞融合是單克隆抗體技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。
實(shí)驗(yàn)原理:B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進(jìn)行無限分裂;而骨髓瘤細(xì)胞可以在體外無限傳代，但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種細(xì)胞融合后，用一特殊選擇培養(yǎng)基(HAT)阻斷正常細(xì)胞或自體融合細(xì)胞的DNA合成通路，而雜交瘤細(xì)胞可利用補(bǔ)救通路合成DNA得以生存，且既能產(chǎn)生抗體，又能無限增殖，并以此生產(chǎn)抗體的技術(shù)。
實(shí)驗(yàn)方法
材料：Balb/c小鼠，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，50%PEG，不完全培養(yǎng)液，HAT培養(yǎng)液，75%酒精，剪刀，鑷子，紗布，離心管，網(wǎng)篩，大小瓶 皿，直頭滴管，彎頭滴管，瓶塞，培養(yǎng)瓶蓋，離心管蓋，燒杯(加入37℃水)，泡沫板，大頭針，96孔培養(yǎng)板，計(jì)時(shí)器，顯微鏡，計(jì)數(shù)板等。
單克隆抗體技術(shù)方法：
顯微鏡下觀察血片或骨髓片，找出異常細(xì)胞。
(1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
1.常用Balb/c小鼠，拉頸處死，浸泡于75%酒精內(nèi)，3～5min。
2.用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，剪一小口，用滴管注入5～6ml不完全培養(yǎng)液(嚴(yán)禁刺破腸管)。
3.反復(fù)沖洗，將沖洗液吸入15ml離心管，1000rpm5min離心，用完全培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞密度。
(2)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的制備
1.選取狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞。
2.棄去原瓶中培養(yǎng)上清，用不完全培養(yǎng)液沖洗三遍。
3.再以不完全培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行充分吹打，得到的細(xì)胞懸液移入15ml離心管。
4.細(xì)胞計(jì)數(shù)。
(3)脾細(xì)胞的制備
1.3天前加強(qiáng)免疫的小鼠，摘眼球取血后，拉頸處死，75%酒精浸泡3～5min。
2.將小鼠固定于泡沫板上，打開腹腔，取出脾臟，用不完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗。
3.在平皿中的網(wǎng)篩中，用鑷子夾取脾臟進(jìn)行反復(fù)研磨，邊磨邊滴加不完全培養(yǎng)液，直到脾細(xì)胞單個(gè)化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入15ml離心管中。
4.細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)兩種細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，調(diào)整懸液用量，配平之后(SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞數(shù)量比值在1：5～1：10之間)，以1000rpm5min離心。
5.棄上清，每管加入5ml不完全培養(yǎng)液，吹打混勻后合并于同一15ml離心管中，再次以1000rpm5min。
6.離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。
(4)細(xì)胞融合
1.前面步驟所得到的細(xì)胞沉淀，輕彈離心管管底，使其呈糊狀。
2.在37℃水浴中，輕輕振蕩，一邊緩緩加入1mlPEG，邊加邊搖，PEG于1min內(nèi)加完。
3.加完P(guān)EG之后，將懸液在37℃水浴中靜置1min。
4.繼續(xù)在37℃水浴中，邊搖邊加入不完全培養(yǎng)液2ml，于2min內(nèi)加完。
5.慢慢加入不完全培養(yǎng)液，800rpm，8min。
6.棄上清，加入含1%HAT、20%FCS的培養(yǎng)液，輕輕混勻。
(5)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入飼養(yǎng)細(xì)胞上清，1滴/孔;之后加入融合細(xì)胞懸液，1滴/孔。
(6)鏡下觀察96孔板中細(xì)胞情況，CO2孵箱中培養(yǎng)。
單克隆抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算:一只小鼠可獲得(1～2.5)×108個(gè)脾細(xì)胞，與(2～3)×107個(gè)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。顯微鏡下可見單個(gè)分散的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)3～5天后即可出現(xiàn)小克隆，雜交瘤細(xì)胞較大，呈圓形且透明，其它細(xì)胞透光性差并逐漸死亡。
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