關(guān)于基因的科技論文范文3000字(2)
關(guān)于基因的科技論文范文3000字篇二
NOX1基因熒光素酶報告基因系統(tǒng)的建立
作者：劉珍 劉偉 劉行海 王伯瑤 黃寧 吳琦
【摘要】 目的：對炎癥細(xì)胞因子TNF?α及IFN?γ刺激下，人NOX1基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行初步分析。方法：將NOX1基因5′?端上游序列連接到無啟動子的PGL3?BASIC質(zhì)粒，構(gòu)建了PGL3?BASIC/NOX1報告質(zhì)粒。PGL3?BASIC/NOX1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，用TNF?α、IFN?γ刺激12h，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測基因表達(dá)情況。結(jié)果：克隆的NOX1片段具有較強(qiáng)的啟動子活性，在TNF?α和IFN?γ共同刺激下，轉(zhuǎn)染報告基因的A549細(xì)胞螢光素酶活性與對照相比有明顯的增高(約4.3倍)。分析顯示NOX1基因5′?端上游序列片段含有NF?κB結(jié)合位點，提示細(xì)胞因子刺激的熒光素酶表達(dá)增強(qiáng)可能與NF?κB位點激活相關(guān)。結(jié)論：NOX1基因表達(dá)水平明顯受到炎癥細(xì)胞因子的調(diào)控，提示該基因可能參與機(jī)體免疫防御(特別是上皮細(xì)胞免疫防御)，值得進(jìn)行深入研究。
【關(guān)鍵詞】 NOX1;報告基因;TNF?α;IFN?γ
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NADPH oxidase, NOX)是一種多蛋白質(zhì)亞基組成的復(fù)合物，表達(dá)于吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中，能產(chǎn)生對抗病原微生物的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，并參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖等過程[1]。在吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)表達(dá)的NADPH氧化酶主要是gp91?phox(NOX2)。
NOX1是近年發(fā)現(xiàn)的gp91?phox同源分子，可在非吞噬細(xì)胞(上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)表達(dá)，當(dāng)該基因表達(dá)增加時，細(xì)胞ROS產(chǎn)生增多，與細(xì)胞增殖和其他細(xì)胞行為相關(guān)[2-3]。目前報道最多的是關(guān)于NOX與機(jī)體絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)和酪氨酸蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系，ROS引起的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變，可激活由MAPK家族不同成員參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。一般認(rèn)為NOX家族與機(jī)體免疫防御密切相關(guān)，但這些分子扮演的具體角色仍待確定，本實驗通過構(gòu)建NOX1基因5′?端上游啟動子序列報告基因，初步分析NOX1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 材料
人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549為本實驗室保存。熒光素酶報告基因載體pGL3?basic，海腎熒光素酶內(nèi)對照報告載體pRL?TK及Dual?Luciferase Report Assay SystemPromega產(chǎn)品。PCR引物由寶生物工程公司合成，限制性內(nèi)切酶購自MBI公司。DNA Ligation Kit 、PFU酶為TaKaRa 公司產(chǎn)品。質(zhì)粒DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)mega 公司。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000購自invitrogen公司。TNF?α、IFN?γ購自PeproTech公司，其余為國產(chǎn)分析純。
1.2 方法
1.2.1 引物設(shè)計與PCR的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中Nox1基因DNA序列(登錄號：DQ314883)，設(shè)計擴(kuò)增Nox1啟動子序列，擴(kuò)增片段長度為2096bp，在兩條引物分別加上KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點。
上游引物P1：CGGGTACCTGAAGGTTGCAGTGAAGGGAGATC。
下游引物P2：GCCTCGAGGGTTTGGAGCCCTTCTAGGC。
PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性3min;94℃變性40sec，58℃退火45sec，72℃延伸2min，30個循環(huán);最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取5μl PCR產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳觀察。
1.2.2 報告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ分別酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pGL3?basic，用DNA連接酶連接兩者，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，DNA測序(大連寶生物公司)。
1.2.3 轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天按照每孔8×104個細(xì)胞接種到48孔板，待細(xì)胞生長至融合度大于90%，換無血清培養(yǎng)基，用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔分別轉(zhuǎn)染2.5μɡ的重組質(zhì)粒，6小時后換為含小牛血清的DMEM培養(yǎng)基500μL，繼續(xù)于37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)，用于下一步細(xì)胞因子刺激實驗。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為重組的熒光素酶報告基因載體pGL3?NOX1及海腎熒光素酶內(nèi)對照報告載體pRL?TK，兩者的比例為200：1。
1.2.4 細(xì)胞因子刺激A549細(xì)胞 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的24-48小時內(nèi)進(jìn)行刺激實驗。用TNF?α，IFN?γ刺激A549細(xì)胞。實驗分組為TNF?α組，IFN?γ組，TNF?α+IFN?γ組。 TNF?α實驗用量為25ng·mL-1，IFN?γ實驗用量為10ng·mL-1。細(xì)胞因子用DMEM培養(yǎng)基稀釋，加入轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞，刺激12小時，用Dual?Luciferase Report Assay System試劑盒中的裂解液PLB裂解細(xì)胞，收集裂解產(chǎn)物，10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，上請儲存于-20℃。熒光素酶報告基因活性測定采用Beckman Coulter DTX880。實驗重復(fù)3次。用未刺激的轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞做陰性對照。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行分析。
2 結(jié)果
2.1 報告基因重組質(zhì)粒(pGL3?NOX1)的構(gòu)建和鑒定
PCR產(chǎn)物電泳顯示擴(kuò)增出的片段與實驗?zāi)康钠未笮∫恢?，將PCR片段插入質(zhì)粒pGL3?basic，用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ及XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，也切下相應(yīng)大小的片段，最后采用DNA測序證實pGL3?NOX1質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。
2.2 細(xì)胞因子對pGL3?NOX1報告基因表達(dá)活性的影響
細(xì)胞因子TNF?α，IFN?γ刺激轉(zhuǎn)染了報告基因的A549細(xì)胞，于刺激后12小時裂解細(xì)胞，檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示單獨采用IFN?γ、TNF?α，或者聯(lián)合采用兩種細(xì)胞因子刺激，與轉(zhuǎn)染pGL3?NOX1報告基因而未加細(xì)胞因子的對照組(DMEM對照)比較，熒光素酶活性分別增加3.2、2.7及4.3倍。經(jīng)SPSS軟件分析，各實驗組與對照組相比，均為P<0.05。結(jié)果見表1和圖2。表1 TNF?α，IFN?γ對NOX1基因報告質(zhì)粒在A549細(xì)胞在中表達(dá)的影響
3 討論
在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等吞噬細(xì)胞質(zhì)膜上, 存在NADPH氧化酶,其主要亞基是gp91?phox,該酶被激活時能招募其他位于細(xì)胞質(zhì)中的亞基,在膜上裝配成活化的全酶,是吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)及依賴氧殺菌作用的關(guān)鍵分子。近年來在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了一組gp91?phox結(jié)構(gòu)與活性同源的分子，于是NADPH氧化酶成為一個分子家族，共有7個成員，分別稱為NOX1?5，Duox1?2。最先在吞噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的gp91?phox現(xiàn)在稱為NOX2。
目前對NOX2在機(jī)體抗感染免疫防御中的地位有相當(dāng)深入的了解，但NOX家族其他成員的生理功能還有待研究。由于NOX2只是特異表達(dá)于吞噬細(xì)胞，NOX家族其他分子則廣泛表達(dá)于機(jī)體各組織器官，它們的生物學(xué)功能立即成為令人感興趣的問題。過去10年對活性氧的生物學(xué)活性有了更多認(rèn)識,它們參與細(xì)胞生存、增殖、分化、衰老和死亡等重要生命過程,是一類信號分子[ 3-5]。NOX家族的發(fā)現(xiàn)，勢必促進(jìn)組織細(xì)胞活性氧的生成代謝及調(diào)控機(jī)理研究。
鑒于NOX2在免疫防御中的重要功能，必然將NOX家族其他分子與機(jī)體抗感染防御相聯(lián)系，這方面的工作也成為眼下的重點之一。比如有實驗揭示活性氧與天然免疫Toll受體信號途徑的聯(lián)系。我們實驗室曾發(fā)現(xiàn)在泌尿道上皮細(xì)胞清除胞內(nèi)細(xì)菌可能有活性氧中的參與。為了深入了解NOX家族與粘膜上皮防御屏障的關(guān)系，本文研究建立了NOX1基因熒光素酶報告基因，旨在深入探討NOX1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以及該基因與炎癥和免疫反應(yīng)的關(guān)系。通過雙熒光報告系統(tǒng)的檢測，我們觀察到炎癥細(xì)胞因子(TNF?α，IFN?γ)刺激可以使實驗組熒光素酶報告基因活性明顯高于對照組，觀察細(xì)胞因子作用后不同時間報告基因表達(dá)水平，以刺激12小時達(dá)到頂峰，然后逐漸下降。本實驗通過報告基因檢測方式，顯示 NOX1基因參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程，提示有必要進(jìn)一步研究該基因在免疫防御中的意義。
而NOX1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)段中，細(xì)胞因子作用的主要位點，也成為今后研究的重要內(nèi)容。通過計算機(jī)程序(gene?regulation.com)分析，顯示本實驗克隆的NOX1基因上游區(qū)段包含有NF?κB結(jié)合位點。NF?κB 轉(zhuǎn)錄因子家族，在細(xì)胞分化、細(xì)胞粘附、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)以及天然免疫等過程中發(fā)揮著重要作用[ 6-8] 。細(xì)胞因子(特別是TNF?α)刺激NOX1基因表達(dá)，NF?κB結(jié)合位點是否于此相關(guān)，值得進(jìn)一步的實驗確定。
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