基因科技論文范文2000字

　　基因科技改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。 下面是小編為大家精心推薦的基因科技論文范文2000字，希望能夠?qū)δ兴鶐椭?/p>

　　基因科技論文范文2000字篇一

　　轉(zhuǎn)基因家畜的新品系培育

　　摘要：分析了利用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)所獲得的G0代轉(zhuǎn)基因家畜外源基因的整合和表達(dá)狀況：在隨機(jī)整合的情況下，存在大量嵌合體現(xiàn)象，不同的整合位點(diǎn)其表達(dá)效應(yīng)不同;應(yīng)用基因打靶技術(shù)實(shí)現(xiàn)定位整合，情況相對(duì)簡單。在此基礎(chǔ)上，提出不同整合類型對(duì)G0代轉(zhuǎn)基因家畜進(jìn)行遴選的方法和程序，以及建立轉(zhuǎn)基因家畜純合體的兩條技術(shù)路線：一是利用遴選出的具有遺傳穩(wěn)定性的G0代個(gè)體，通過常規(guī)繁育獲得;二是利用基因打靶技術(shù)，獲得雙等位基因整合(或敲除)的家畜。最后根據(jù)家畜育種的理論，提出了建立轉(zhuǎn)基因新品系、進(jìn)而形成新品種的步驟。

　　關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因家畜;純合體;新品系

　　中圖分類號(hào)：S813.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114(2011)18-3785-05

　　The Breeding of Transgenic Livestock New Lines

　　WEI Qing-xin，ZHENG Xin-min

　　(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science ，Hubei Academy of Agriculture Sciences/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding， Wuhan 430064，China)

　　Abstract： The integration and expression of foreign genes in the G0 transgenic livestock’s which obtained by using existed transgenic technology were first analysized. There were a lot of chimerism in the cases of random integration， and the expression effects were also different in different integration sites. It should be relatively simple if targeted integration was achieved by gene targeting technology. On this basis， the methods and procedures of the selection for G0 transgenic animals in different integration types were proposed， and two technical routes for homozygous transgenic animals were established. The first one was to select genetic stable G0 individuals and obtain homozygote through conventional breeding. The second one was to repeatly use somatic cell gene targeting to obtain the livestock with dual-allele interaction (or knockout). Finally， according tothe livestock breeding theory， the proncess of constructing a new trangenic line and then forming a new species based on the transgenic homozygous individuals was put forward.

　　Key words： transgenic livestock; homozygotes; new lines

　　應(yīng)用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備出轉(zhuǎn)基因家畜個(gè)體，再到培育成一個(gè)轉(zhuǎn)基因新品系、進(jìn)而培育成新品種，還有大量的選育工作要做和相當(dāng)長的育種路程。無論用哪一種轉(zhuǎn)基因方法得到的原代轉(zhuǎn)基因家畜(G0代，由轉(zhuǎn)基因的胚胎發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[1])，都只是育種的初始材料，有的還不能作為育種的材料。G0代轉(zhuǎn)基因家畜能否作為育種材料，取決于其外源基因遺傳的穩(wěn)定性，以及其表達(dá)水平是否達(dá)到預(yù)期要求。而G0代轉(zhuǎn)基因家畜遺傳穩(wěn)定性以及表達(dá)水平，則與外源基因整合的位點(diǎn)和整合的狀況有關(guān)。按目前的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，G0代轉(zhuǎn)基因豬外源基因一般只是整合在同源染色體中的一條染色體上，可稱其為“雜合體”。只有獲得“純合體”(同源染色體上的相同位點(diǎn)都整合有外源基因)，才能進(jìn)行下一步的建立家系、品系等育種工作。在建立轉(zhuǎn)基因品系的過程中，還要兼顧其他經(jīng)濟(jì)性狀的選育?？梢姡瑥霓D(zhuǎn)基因家畜個(gè)體到培育成轉(zhuǎn)基因新品系，是分子選擇與常規(guī)育種相結(jié)合的過程。

　　本研究提出建立轉(zhuǎn)基因家畜新品系的方法和步驟，僅供參考。

　　1外源基因在G0代轉(zhuǎn)基因家畜中的整合狀況

　　目前的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，外源基因的整合有兩種情況：一種是隨機(jī)整合;另一種是定位整合。外源基因的定位整合，一般是通過基因打靶技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。

　　1.1隨機(jī)整合

　　1.1.1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的嵌合體現(xiàn)象所謂轉(zhuǎn)基因動(dòng)物嵌合體是指：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物由轉(zhuǎn)基因的和非轉(zhuǎn)基因的兩種細(xì)胞、或由兩種或兩種以上不同類型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞構(gòu)成[1]。下列幾種情況，有可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因嵌合體的產(chǎn)生：其一，與外源基因整合的時(shí)機(jī)有關(guān)，如果胚胎或細(xì)胞導(dǎo)入基因的時(shí)機(jī)染色體已經(jīng)復(fù)制，則形成嵌合體的可能性較大。其二，對(duì)兩個(gè)細(xì)胞期以上的胚胎進(jìn)行基因?qū)?，例如?duì)兩個(gè)細(xì)胞期的胚胎進(jìn)行外源基因的顯微注射，多數(shù)會(huì)形成嵌合體。其三，在胚胎細(xì)胞的分裂和分化過程中，一部分插入DNA被修飾，也會(huì)形成嵌合體。有研究表明，應(yīng)用顯微注射的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，嵌合體的比例大約占65%左右[2，3]。在轉(zhuǎn)基因嵌合體中，如果生殖細(xì)胞中有外源基因的嵌合，則可以將轉(zhuǎn)基因傳遞給后代;否則，就不能將轉(zhuǎn)基因傳遞給后代。這就是有些G0代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不能傳代的原因之一。

　　1.1.2外源基因的整合位點(diǎn)及其效應(yīng)非基因打靶的外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞后將隨機(jī)地插入受體基因組中的任意位置[1]。牛迄東等[4]用地高辛標(biāo)記探針對(duì)3頭G0代轉(zhuǎn)pGH豬染色體進(jìn)行原位雜交，結(jié)果表明，其外源基因分別定位在7q14、6p12、8p22上。陳付學(xué)等 [5]應(yīng)用非同位素原位雜交技術(shù)，研究轉(zhuǎn)基因豬外源hDAF基因在受體基因組染色體上的整合及其定位，結(jié)果表明，6頭G0代轉(zhuǎn)hDAF豬外源基因分別定位在2p、6p14、7p11、7q26、11q12和13q44上。這些試驗(yàn)結(jié)果可以說明，不同的G0代個(gè)體外源基因的整合位點(diǎn)不同，顯示出其隨機(jī)性。

　　轉(zhuǎn)基因的表達(dá)與其整合位點(diǎn)有關(guān)，不同的整合位點(diǎn)，表現(xiàn)出不一樣的表達(dá)效果，稱之為轉(zhuǎn)基因的“位點(diǎn)效應(yīng)”。朱作言等[6]將轉(zhuǎn)基因的“位點(diǎn)效應(yīng)”分為三種類型，即“有效整合”、“沉默整合”和“毒性整合”。轉(zhuǎn)基因的有效整合位點(diǎn)應(yīng)具備兩個(gè)特征：其一，轉(zhuǎn)基因能有效表達(dá);其二，避免干擾基因組功能基因的表達(dá)調(diào)控或破壞基因結(jié)構(gòu)。無表達(dá)作用的整合為“沉默整合”，其整合位點(diǎn)常發(fā)生在染色體異染色質(zhì)區(qū)。“毒性整合”的位點(diǎn)一般在常染色區(qū)，由于干擾了基因組功能基因的表達(dá)調(diào)控或破壞了正?；虻慕Y(jié)構(gòu)，而導(dǎo)致胚胎或個(gè)體生長發(fā)育受阻、畸形甚至夭折。

　　有效整合的位點(diǎn)具有遺傳的穩(wěn)定性。樊俊華等[7]對(duì)來自同一G0代親本的G1、G2、G3代轉(zhuǎn)PGH基因豬，采用非同位素標(biāo)記的染色體原位雜交技術(shù)進(jìn)行了定位檢測，結(jié)果表明，外源基因均定位于13q12上。表明能夠傳代的G0代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其后代的整合位點(diǎn)是相對(duì)穩(wěn)定的。

　　1.1.3外源基因的整合形式外源基因隨機(jī)整合的形式有三種：單拷貝單一位點(diǎn)整合，多拷貝串聯(lián)單一位點(diǎn)整合，多拷貝多位點(diǎn)整合。多拷貝整合，外源DNA通常呈現(xiàn)多串狀整合;在絕大多數(shù)情況下，某一位點(diǎn)上多拷貝串狀整合的外源基因，采取頭尾相連的排列方式;這些方向一致的串狀拷貝，是被導(dǎo)入DNA的完整或近乎完整的拷貝，少數(shù)情況下也有在兩個(gè)相鄰拷貝結(jié)合的地方出現(xiàn)小的不完整;在稀有的情況下，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)拷貝呈現(xiàn)頭對(duì)頭或尾對(duì)尾的連接方式，在這種情況下常發(fā)生末端缺失[1]。轉(zhuǎn)基因的另一種變化是某些堿基被甲基化。轉(zhuǎn)基因拷貝的不完整、末端缺失或甲基化，都會(huì)影響基因表達(dá)和遺傳的穩(wěn)定性。多拷貝串聯(lián)的拷貝數(shù)可從幾個(gè)到100個(gè)以上。Hammer等[8]以定量斑點(diǎn)雜交法，檢測轉(zhuǎn)基因豬整合外源基因的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)整合MT-hGH基因拷貝數(shù)在1～490個(gè)，整合MT-bHG基因拷貝數(shù)在1～28個(gè)，整合MT-hGRF基因拷貝數(shù)在30～100個(gè)?？讘c然等[9]采用定量 PCR 技術(shù)，檢測了兩頭體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬，其外源基因拷貝數(shù)分別為(30.85±1.77)個(gè)和 (18.87±1.34)個(gè)。

　　已有的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究，尚未見轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)與表達(dá)水平之間具有很明確相關(guān)性的報(bào)道。但這是需要進(jìn)一步深入研究的問題。

　　1.2定位整合

　　外源基因的定位整合一般是通過基因打靶實(shí)現(xiàn)的，基因打靶是精確地人工修飾基因組的一種技術(shù)。這種技術(shù)的特征在于：第一，具有直接性，直接作用于靶基因，不涉及基因組的其他位置;第二，具有準(zhǔn)確性，可以將設(shè)計(jì)好的DNA序列插入選定的目標(biāo)基因座，或者用設(shè)計(jì)好的DNA序列去取代基因座中相應(yīng)的DNA序列。因此，通過基因打靶技術(shù)制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，應(yīng)不存在轉(zhuǎn)基因的嵌合體現(xiàn)象，其整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)也應(yīng)是確定的。

　　對(duì)于家畜而言，實(shí)現(xiàn)外源基因的定位整合(或基因敲除)，必須通過核移植的程序。目前體細(xì)胞核移植生產(chǎn)克隆家畜的效率很低，大量的重構(gòu)胚在孕育期死亡，出生后的個(gè)體生長發(fā)育不正常、甚至死亡的頻率也很高。這些情況，應(yīng)主要是由于克隆技術(shù)不完善而導(dǎo)致的;但也不能排除一部分是由于外源基因(或敲除基因)的表達(dá)或整合位點(diǎn)的不當(dāng)所致。

　　2G0代轉(zhuǎn)基因家畜的遴選

　　了解了外源基因在G0代轉(zhuǎn)基因家畜中的整合和表達(dá)狀況，就不難理解要進(jìn)行定向育種，就必須對(duì)G0代轉(zhuǎn)基因個(gè)體進(jìn)行遴選。

　　2.1遴選的內(nèi)容和目標(biāo)

　　G0代轉(zhuǎn)基因家畜是建立新品系的原始材料，遴選正確與否，將決定今后育種工作能否進(jìn)行下去。選擇內(nèi)容應(yīng)包括如下幾點(diǎn)：①G0代轉(zhuǎn)基因家畜的生長發(fā)育、繁殖性能是否正常;②外源基因的表達(dá)是否達(dá)到預(yù)期;③外源基因整合和表達(dá)水平是否具有遺傳穩(wěn)定性。

　　最終的遴選目標(biāo)應(yīng)是：生長發(fā)育和繁殖性能正常，外源基因的表達(dá)水平達(dá)到預(yù)期，且具有遺傳穩(wěn)定性的個(gè)體。

　　2.2遴選程序

　　2.2.1G0代生長發(fā)育、繁殖性能和生理生化指標(biāo)的測定和評(píng)價(jià)對(duì)所有G0代個(gè)體按家畜育種的常規(guī)進(jìn)行飼養(yǎng)管理(有些種類的轉(zhuǎn)基因家畜也許需要特殊的飼養(yǎng)管理)并觀測其生長發(fā)育和繁殖性能，在規(guī)定的日齡進(jìn)行生理生化指標(biāo)的檢測，重點(diǎn)觀察有無異?；蚱渌牟±肀憩F(xiàn)。所有測定和檢測，均應(yīng)以同窩非轉(zhuǎn)基因家畜或親本品種的成績作為對(duì)照。

　　2.2.2G0代轉(zhuǎn)基因家畜的表達(dá)檢測對(duì)生長發(fā)育、繁殖性能和生理生化指標(biāo)正常的G0代轉(zhuǎn)基因家畜，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的表達(dá)檢測。表達(dá)檢測的程序，應(yīng)首先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄(mRNA)水平的檢測，然后進(jìn)行翻譯水平(蛋白質(zhì)水平)的定性和定量檢測，有些還要進(jìn)行生物活性的檢測、功能測試和性能測定。從而選擇出達(dá)到預(yù)期表達(dá)水平的G0代轉(zhuǎn)基因個(gè)體。

　　2.2.3G0代個(gè)體遺傳穩(wěn)定性測定測定G0代轉(zhuǎn)基因個(gè)體的遺傳穩(wěn)定性，需進(jìn)行繁殖傳代，從后代的檢測情況進(jìn)行判斷。

　　對(duì)于隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，繁殖傳代應(yīng)采取如下方式：雄性G0代個(gè)體應(yīng)與非轉(zhuǎn)基因的雌性個(gè)體進(jìn)行交配，雌性G0代轉(zhuǎn)基因個(gè)體應(yīng)與非轉(zhuǎn)基因雄性個(gè)體交配。按照這樣的交配方式，從理論上，遺傳穩(wěn)定的G0代個(gè)體，其后代的陽性率應(yīng)為50%。實(shí)際操作中，在后代個(gè)體數(shù)不少于30個(gè)樣本的情況下，接近50%即可，樣本量越大，越應(yīng)接近50%。切忌G0代不同性別個(gè)體之間的交配，因?yàn)槊款^G0代個(gè)體整合的位點(diǎn)不一，表達(dá)水平不同，同時(shí)還存在轉(zhuǎn)基因嵌合體的可能，這種交配方式所產(chǎn)生后代的檢測結(jié)果無法說明任何一個(gè)親本的遺傳性。

　　對(duì)于定位整合技術(shù)制備的G0代轉(zhuǎn)基因個(gè)體，應(yīng)首先進(jìn)行外源基因的定位檢測，以判斷其是否按照預(yù)期整合到相應(yīng)的位點(diǎn)上;同時(shí)進(jìn)行表達(dá)檢測，定位整合的G0代個(gè)體其表達(dá)水平應(yīng)該是基本一致的，但允許有一定的差別(同位點(diǎn)、相同拷貝數(shù)的整合，由于個(gè)體之間的差異，也會(huì)出現(xiàn)表達(dá)水平的差別)。即使整合與表達(dá)的檢測都達(dá)到了預(yù)期的G0代個(gè)體，也必須通過傳代來判斷其是否具有遺傳的穩(wěn)定性。其繁殖傳代的方式可有兩種：一種方式如前所述，即G0代轉(zhuǎn)基因個(gè)體與非轉(zhuǎn)基因個(gè)體進(jìn)行交配，如后代的陽性率50%左右，且G1的表達(dá)水平基本達(dá)到了轉(zhuǎn)基因親本的水平，即可初步認(rèn)為該G0代轉(zhuǎn)基因個(gè)體具有遺傳穩(wěn)定性;另一種方式，即兩頭具有不同性別的G0代個(gè)體之間的交配，其產(chǎn)生的子代(G1)如果陽性率為75%左右，就可以初步認(rèn)為該兩頭G0代個(gè)體均具有遺傳穩(wěn)定性。

　　最終判定G0代轉(zhuǎn)基因個(gè)體的遺傳是否穩(wěn)定，還有賴于由該G0代所產(chǎn)生的G1、G2，甚至于G3、G4代的檢測結(jié)果。

　　3轉(zhuǎn)基因家畜純合體的建立

　　建立轉(zhuǎn)基因家畜的純合體(或純合子)可有兩條路線：一是利用遴選出的具有遺傳穩(wěn)定性的G0代個(gè)體，通過常規(guī)繁育獲得;二是利用體細(xì)胞二次基因打靶，獲得雙等位基因整合(或敲除)的家畜。第一條路線耗時(shí)長，而且還有近交風(fēng)險(xiǎn);第二條路線可一步到位，但技術(shù)難度大。

　　3.1通過常規(guī)繁育建立轉(zhuǎn)基因純合體

　　3.1.1隨機(jī)整合轉(zhuǎn)基因純合體的獲得隨機(jī)整合的情況下，G0代個(gè)體之間整合的位點(diǎn)不一，整合的拷貝數(shù)不同，表達(dá)水平也有差別。如果不同性別的G0代個(gè)體之間進(jìn)行交配，無法得到雙等位基因整合的后代，因此也就不能得到轉(zhuǎn)基因純合體。只有G0代個(gè)體與非轉(zhuǎn)基因個(gè)體交配所產(chǎn)生的G1代，其整合的位點(diǎn)、整合的拷貝數(shù)和表達(dá)水平才會(huì)是一致的;進(jìn)而進(jìn)行G1代之間的交配，在近交所產(chǎn)生的G2代中，才能篩選出轉(zhuǎn)基因純合體。其近交的方式可有如下兩種。

　　全同胞近交：交配模式如圖1所示。

　　在圖1的交配模式中，G2代轉(zhuǎn)基因個(gè)體的比例應(yīng)為總產(chǎn)仔數(shù)的75%;而在G2代轉(zhuǎn)基因個(gè)體中，純合體應(yīng)占1/3。

　　半同胞近交：除個(gè)別作為試驗(yàn)動(dòng)物用的動(dòng)物外，作為商業(yè)生產(chǎn)的家畜品種，并沒有嚴(yán)格生物學(xué)意義上的近交系。非近交系的家畜實(shí)行近交，會(huì)出現(xiàn)近交衰退的現(xiàn)象。近交的程度越高，近交衰退的現(xiàn)象也就越嚴(yán)重。為了降低近交衰退的風(fēng)險(xiǎn)，可采用半同胞近交，交配模式如圖2所示。圖2的交配模式，G2代轉(zhuǎn)基因個(gè)體中純合體亦應(yīng)占1/3。

　　3.1.2定位整合轉(zhuǎn)基因純合體的獲得應(yīng)用定位整合技術(shù)所獲得的G0代轉(zhuǎn)基因個(gè)體之間，由于其整合位點(diǎn)、整合拷貝數(shù)相同，表達(dá)水平也基本一致，因此可以直接用不同性別相互交配的方法得到純合體。如圖3所示。在圖3的交配模式中，G1代轉(zhuǎn)基因個(gè)體的比例應(yīng)占總產(chǎn)仔數(shù)的75%，而純合體應(yīng)占G1代轉(zhuǎn)基因個(gè)體的1/3。

　　3.1.3轉(zhuǎn)基因純合體的鑒定與篩選上述無論哪一種交配模式，都需要將純合體從轉(zhuǎn)基因的群體中篩選出來。鑒定純合體的方法有兩種：第一種是實(shí)驗(yàn)室方法，近年來發(fā)展建立了一些純合體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定的實(shí)驗(yàn)室方法，如熒光原位雜交法(FISH)、Southern雜交法和熒光實(shí)時(shí)定量PCR法等。這些方法已成功地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小鼠純合體的篩選。第二種是常規(guī)繁育法，實(shí)驗(yàn)室方法的檢測結(jié)果只能作為參考，最終確認(rèn)純合體還必須通過常規(guī)繁育的方法。轉(zhuǎn)基因個(gè)體與非轉(zhuǎn)基因個(gè)體交配，如果其后代100%是轉(zhuǎn)基因的，就可以確認(rèn)該轉(zhuǎn)基因親本是純合體;否則其轉(zhuǎn)基因親本仍然是“雜合子”。

　　3.2通過基因重復(fù)打靶技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因家畜純合體

　　通過常規(guī)繁育技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因家畜純合體耗時(shí)很長。以豬為例：豬的世代間隔為1年左右，如前所述，隨機(jī)整合的G0代轉(zhuǎn)基因豬通過兩個(gè)世代的繁育，加上鑒定純合體的一個(gè)世代，至少需要3年的時(shí)間才能最終篩選出純合體;即使是定位整合的G0代轉(zhuǎn)基因豬，至少也需要2年的時(shí)間才能最終篩選出純合體。對(duì)于牛等世代間隔長的家畜，其所耗費(fèi)的時(shí)間就更長。體細(xì)胞的基因重復(fù)打靶技術(shù)為解決上述問題提供了可以一次到位的技術(shù)路線。Kuroiwa等[10]對(duì)牛成纖維細(xì)胞進(jìn)行PRNP基因的打靶，并通過克隆技術(shù)構(gòu)建重構(gòu)胚，重構(gòu)胚移植到子宮內(nèi)發(fā)育成75日齡的胎兒實(shí)施流產(chǎn)并再次分離其成纖維細(xì)胞;然后進(jìn)行重復(fù)打靶獲得純合型基因敲除細(xì)胞，以純合型基因敲除細(xì)胞作為核供體，構(gòu)建成PRNP雙等位基因位點(diǎn)失活的轉(zhuǎn)基因牛。

　　體細(xì)胞基因重復(fù)打靶的關(guān)鍵技術(shù)有兩點(diǎn)：一是要利用目標(biāo)基因及其相鄰序列，構(gòu)建A和B兩種基因打靶載體，分別用于敲除兩條姊妹染色體上的目標(biāo)基因拷貝;A、B兩種載體分別用不同的標(biāo)記，如GFP和RFP，防止兩種標(biāo)記基因相互干擾。二是要建立“細(xì)胞拯救技術(shù)”。在體細(xì)胞上實(shí)施基因打靶的制約因素，是細(xì)胞壽命太短。由于細(xì)胞增殖的代數(shù)有限，往往是尚未確定是否實(shí)現(xiàn)了靶向基因交換，細(xì)胞就進(jìn)入凋亡期，難以把細(xì)胞還原成動(dòng)物個(gè)體。但是，體細(xì)胞經(jīng)過核移植過程之后，可以重新啟動(dòng)發(fā)育程序，其壽命得到更新。根據(jù)這個(gè)原理，在兩輪基因打靶之間引入細(xì)胞拯救過程，使第一輪基因打靶中的陽性細(xì)胞得以更新。這一技術(shù)步驟能將細(xì)胞團(tuán)擴(kuò)增為胎兒組織，生產(chǎn)大量均質(zhì)的細(xì)胞，這些細(xì)胞不僅可以滿足進(jìn)一步分子檢測需要，同時(shí)為完成第二輪基因打靶爭取到足夠的時(shí)間。

　　完成兩次基因打靶核移植出生的后代，應(yīng)該全部是雙等位基因整合(或敲除)的純合體。但最終的確認(rèn)還是要通過實(shí)驗(yàn)室檢測和常規(guī)繁育的方法，轉(zhuǎn)基因個(gè)體與非轉(zhuǎn)基因個(gè)體交配，如果其后代100%是轉(zhuǎn)基因的，就可以確認(rèn)該轉(zhuǎn)基因親本是純合體。

　　4轉(zhuǎn)基因家畜新品種的建立

　　得到遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因純合體家畜后的工作便是進(jìn)入常規(guī)育種的程序。為了監(jiān)測外源基因在進(jìn)入常規(guī)育種傳代過程中是否丟失或變異，需要對(duì)后代逐頭進(jìn)行分子檢測。

　　4.1轉(zhuǎn)基因新品系的建立

　　建立轉(zhuǎn)基因新品系，可采用系祖建系法，即以經(jīng)過篩選的純合體為系祖建立品系。以豬為例：豬的品系群最低應(yīng)不少于6個(gè)血統(tǒng)的6頭公豬和30～40頭母豬所組成[11]，形成這樣的一個(gè)遺傳穩(wěn)定、表達(dá)水平基本一致的群體，就可以認(rèn)為轉(zhuǎn)基因豬新品系建立成功。

　　4.1.1隨機(jī)整合轉(zhuǎn)基因家畜新品系的建立隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)基因家畜個(gè)體之間，外源基因整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)不一致，如果用來源不同(G0代不是同一個(gè)體)的純合體之間交配，所得到的后代又成為新的雜合體。因此，只能采用同一來源(G0代為同一個(gè)體)的純合體之間交配，才能保證后代的純合性和遺傳穩(wěn)定性。這就增加了建系的難度，過高的近交系數(shù)會(huì)導(dǎo)致群體的衰退，生命力下降，有的或許難以為續(xù)。因此，在建立純合體的過程中，一是要盡可能采用半同胞近交的方式;二是選擇的非轉(zhuǎn)基因個(gè)體與G0代轉(zhuǎn)基因個(gè)體之間，以及非轉(zhuǎn)基因個(gè)體之間，應(yīng)盡量避開血緣關(guān)系。

　　以來源于同一頭G0代轉(zhuǎn)基因家畜的若干純合體(G2代)，經(jīng)各種性狀的選擇之后，首先建立若干個(gè)家系。在建立家系的過程中，設(shè)計(jì)公、母畜之間的交配組合，也要盡量降低近交系數(shù)。在建立家系的基礎(chǔ)上，按育種計(jì)劃的數(shù)量，選擇其中優(yōu)秀的公、母畜個(gè)體，進(jìn)行純繁擴(kuò)群，建立核心群，進(jìn)而形成品系。

　　4.1.2定位整合轉(zhuǎn)基因家畜新品系的建立應(yīng)用定位整合技術(shù)制備的轉(zhuǎn)基因家畜，其新品系的建立比隨機(jī)整合要簡單、易行。無論來源是否相同(G0代是否為同一個(gè)體)的純合體，其交配的后代都是純合體。這就可以容易地避開血緣關(guān)系，降低或防止近交衰退。

　　如果是應(yīng)用重復(fù)打靶技術(shù)獲得的純合體轉(zhuǎn)基因家畜，從G0代就可以進(jìn)行選擇并建立家系的工作。

　　從不同整合類型轉(zhuǎn)基因家畜新品系建立的過程中，可見定位整合乃至于雙等位基因整合對(duì)于轉(zhuǎn)基因育種的重要性;同時(shí)啟示我們，如果出于育種的目的制備轉(zhuǎn)基因家畜，從一開始就應(yīng)考慮后期育種工作的復(fù)雜性，從而選擇合適的轉(zhuǎn)基因技術(shù)路線。

　　4.2轉(zhuǎn)基因新品種的建立

　　我國豬育種工作者認(rèn)為，一個(gè)豬的品種，至少應(yīng)有3個(gè)以上的品系。每個(gè)品系之間應(yīng)有不同的品質(zhì)[11]。對(duì)于轉(zhuǎn)基因豬的所有品系而言，轉(zhuǎn)基因所表達(dá)性狀的品質(zhì)應(yīng)該是共同具備的。而品系之間品質(zhì)的不同，則可以從以下幾方面體現(xiàn)：①以制備轉(zhuǎn)基因豬時(shí)所用不同親本的品系為基礎(chǔ)，建立若干個(gè)轉(zhuǎn)基因品系;②以轉(zhuǎn)基因性狀表達(dá)水平的差異，建立若干個(gè)品系。③隨著轉(zhuǎn)基因品系擴(kuò)繁規(guī)模的擴(kuò)大，會(huì)逐步分布在不同的地區(qū)和不同的飼養(yǎng)場。不同的地區(qū)或不同的飼養(yǎng)場，其飼料結(jié)構(gòu)、自然條件、飼養(yǎng)管理方法的不同，會(huì)形成若干各具特點(diǎn)、互有差別(這些特點(diǎn)或差別應(yīng)主要體現(xiàn)在常規(guī)性狀上)的類群，從而形成若干新的品系。

　　至今尚未見任何一種轉(zhuǎn)基因家畜新品種培育成功的報(bào)道，其過程也許比本研究描述的這些要復(fù)雜、困難得多，會(huì)有許多現(xiàn)在還預(yù)料不到的事情發(fā)生。只有在今后的育種實(shí)踐中，不斷探索、總結(jié)和完善，形成轉(zhuǎn)基因家畜育種的新的理論和方法。

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