基因科技論文范文2000字

　　基因科技改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。 下面是小編為大家精心推薦的基因科技論文范文2000字，希望能夠對您有所幫助。

　　基因科技論文范文2000字篇一

　　轉基因家畜的新品系培育

　　摘要：分析了利用現有的轉基因技術所獲得的G0代轉基因家畜外源基因的整合和表達狀況：在隨機整合的情況下，存在大量嵌合體現象，不同的整合位點其表達效應不同;應用基因打靶技術實現定位整合，情況相對簡單。在此基礎上，提出不同整合類型對G0代轉基因家畜進行遴選的方法和程序，以及建立轉基因家畜純合體的兩條技術路線：一是利用遴選出的具有遺傳穩(wěn)定性的G0代個體，通過常規(guī)繁育獲得;二是利用基因打靶技術，獲得雙等位基因整合(或敲除)的家畜。最后根據家畜育種的理論，提出了建立轉基因新品系、進而形成新品種的步驟。

　　關鍵詞：轉基因家畜;純合體;新品系

　　中圖分類號：S813.3文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2011)18-3785-05

　　The Breeding of Transgenic Livestock New Lines

　　WEI Qing-xin，ZHENG Xin-min

　　(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science ，Hubei Academy of Agriculture Sciences/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding， Wuhan 430064，China)

　　Abstract： The integration and expression of foreign genes in the G0 transgenic livestock’s which obtained by using existed transgenic technology were first analysized. There were a lot of chimerism in the cases of random integration， and the expression effects were also different in different integration sites. It should be relatively simple if targeted integration was achieved by gene targeting technology. On this basis， the methods and procedures of the selection for G0 transgenic animals in different integration types were proposed， and two technical routes for homozygous transgenic animals were established. The first one was to select genetic stable G0 individuals and obtain homozygote through conventional breeding. The second one was to repeatly use somatic cell gene targeting to obtain the livestock with dual-allele interaction (or knockout). Finally， according tothe livestock breeding theory， the proncess of constructing a new trangenic line and then forming a new species based on the transgenic homozygous individuals was put forward.

　　Key words： transgenic livestock; homozygotes; new lines

　　應用現有的轉基因技術制備出轉基因家畜個體，再到培育成一個轉基因新品系、進而培育成新品種，還有大量的選育工作要做和相當長的育種路程。無論用哪一種轉基因方法得到的原代轉基因家畜(G0代，由轉基因的胚胎發(fā)育成的轉基因動物[1])，都只是育種的初始材料，有的還不能作為育種的材料。G0代轉基因家畜能否作為育種材料，取決于其外源基因遺傳的穩(wěn)定性，以及其表達水平是否達到預期要求。而G0代轉基因家畜遺傳穩(wěn)定性以及表達水平，則與外源基因整合的位點和整合的狀況有關。按目前的轉基因技術，G0代轉基因豬外源基因一般只是整合在同源染色體中的一條染色體上，可稱其為“雜合體”。只有獲得“純合體”(同源染色體上的相同位點都整合有外源基因)，才能進行下一步的建立家系、品系等育種工作。在建立轉基因品系的過程中，還要兼顧其他經濟性狀的選育?？梢?，從轉基因家畜個體到培育成轉基因新品系，是分子選擇與常規(guī)育種相結合的過程。

　　本研究提出建立轉基因家畜新品系的方法和步驟，僅供參考。

　　1外源基因在G0代轉基因家畜中的整合狀況

　　目前的轉基因技術，外源基因的整合有兩種情況：一種是隨機整合;另一種是定位整合。外源基因的定位整合，一般是通過基因打靶技術實現的。

　　1.1隨機整合

　　1.1.1轉基因動物的嵌合體現象所謂轉基因動物嵌合體是指：轉基因動物由轉基因的和非轉基因的兩種細胞、或由兩種或兩種以上不同類型的轉基因細胞構成[1]。下列幾種情況，有可能導致轉基因嵌合體的產生：其一，與外源基因整合的時機有關，如果胚胎或細胞導入基因的時機染色體已經復制，則形成嵌合體的可能性較大。其二，對兩個細胞期以上的胚胎進行基因導入，例如對兩個細胞期的胚胎進行外源基因的顯微注射，多數會形成嵌合體。其三，在胚胎細胞的分裂和分化過程中，一部分插入DNA被修飾，也會形成嵌合體。有研究表明，應用顯微注射的方法進行轉基因，嵌合體的比例大約占65%左右[2，3]。在轉基因嵌合體中，如果生殖細胞中有外源基因的嵌合，則可以將轉基因傳遞給后代;否則，就不能將轉基因傳遞給后代。這就是有些G0代轉基因動物不能傳代的原因之一。

　　1.1.2外源基因的整合位點及其效應非基因打靶的外源DNA導入受體細胞后將隨機地插入受體基因組中的任意位置[1]。牛迄東等[4]用地高辛標記探針對3頭G0代轉pGH豬染色體進行原位雜交，結果表明，其外源基因分別定位在7q14、6p12、8p22上。陳付學等 [5]應用非同位素原位雜交技術，研究轉基因豬外源hDAF基因在受體基因組染色體上的整合及其定位，結果表明，6頭G0代轉hDAF豬外源基因分別定位在2p、6p14、7p11、7q26、11q12和13q44上。這些試驗結果可以說明，不同的G0代個體外源基因的整合位點不同，顯示出其隨機性。

　　轉基因的表達與其整合位點有關，不同的整合位點，表現出不一樣的表達效果，稱之為轉基因的“位點效應”。朱作言等[6]將轉基因的“位點效應”分為三種類型，即“有效整合”、“沉默整合”和“毒性整合”。轉基因的有效整合位點應具備兩個特征：其一，轉基因能有效表達;其二，避免干擾基因組功能基因的表達調控或破壞基因結構。無表達作用的整合為“沉默整合”，其整合位點常發(fā)生在染色體異染色質區(qū)。“毒性整合”的位點一般在常染色區(qū)，由于干擾了基因組功能基因的表達調控或破壞了正?；虻慕Y構，而導致胚胎或個體生長發(fā)育受阻、畸形甚至夭折。

　　有效整合的位點具有遺傳的穩(wěn)定性。樊俊華等[7]對來自同一G0代親本的G1、G2、G3代轉PGH基因豬，采用非同位素標記的染色體原位雜交技術進行了定位檢測，結果表明，外源基因均定位于13q12上。表明能夠傳代的G0代轉基因動物，其后代的整合位點是相對穩(wěn)定的。

　　1.1.3外源基因的整合形式外源基因隨機整合的形式有三種：單拷貝單一位點整合，多拷貝串聯(lián)單一位點整合，多拷貝多位點整合。多拷貝整合，外源DNA通常呈現多串狀整合;在絕大多數情況下，某一位點上多拷貝串狀整合的外源基因，采取頭尾相連的排列方式;這些方向一致的串狀拷貝，是被導入DNA的完整或近乎完整的拷貝，少數情況下也有在兩個相鄰拷貝結合的地方出現小的不完整;在稀有的情況下，發(fā)現兩個拷貝呈現頭對頭或尾對尾的連接方式，在這種情況下常發(fā)生末端缺失[1]。轉基因的另一種變化是某些堿基被甲基化。轉基因拷貝的不完整、末端缺失或甲基化，都會影響基因表達和遺傳的穩(wěn)定性。多拷貝串聯(lián)的拷貝數可從幾個到100個以上。Hammer等[8]以定量斑點雜交法，檢測轉基因豬整合外源基因的拷貝數，發(fā)現整合MT-hGH基因拷貝數在1～490個，整合MT-bHG基因拷貝數在1～28個，整合MT-hGRF基因拷貝數在30～100個?？讘c然等[9]采用定量 PCR 技術，檢測了兩頭體細胞核移植技術生產的綠色熒光蛋白轉基因豬，其外源基因拷貝數分別為(30.85±1.77)個和 (18.87±1.34)個。

　　已有的轉基因動物研究，尚未見轉基因拷貝數與表達水平之間具有很明確相關性的報道。但這是需要進一步深入研究的問題。

　　1.2定位整合

　　外源基因的定位整合一般是通過基因打靶實現的，基因打靶是精確地人工修飾基因組的一種技術。這種技術的特征在于：第一，具有直接性，直接作用于靶基因，不涉及基因組的其他位置;第二，具有準確性，可以將設計好的DNA序列插入選定的目標基因座，或者用設計好的DNA序列去取代基因座中相應的DNA序列。因此，通過基因打靶技術制備的轉基因動物，應不存在轉基因的嵌合體現象，其整合位點和拷貝數也應是確定的。

　　對于家畜而言，實現外源基因的定位整合(或基因敲除)，必須通過核移植的程序。目前體細胞核移植生產克隆家畜的效率很低，大量的重構胚在孕育期死亡，出生后的個體生長發(fā)育不正常、甚至死亡的頻率也很高。這些情況，應主要是由于克隆技術不完善而導致的;但也不能排除一部分是由于外源基因(或敲除基因)的表達或整合位點的不當所致。

　　2G0代轉基因家畜的遴選

　　了解了外源基因在G0代轉基因家畜中的整合和表達狀況，就不難理解要進行定向育種，就必須對G0代轉基因個體進行遴選。

　　2.1遴選的內容和目標

　　G0代轉基因家畜是建立新品系的原始材料，遴選正確與否，將決定今后育種工作能否進行下去。選擇內容應包括如下幾點：①G0代轉基因家畜的生長發(fā)育、繁殖性能是否正常;②外源基因的表達是否達到預期;③外源基因整合和表達水平是否具有遺傳穩(wěn)定性。

　　最終的遴選目標應是：生長發(fā)育和繁殖性能正常，外源基因的表達水平達到預期，且具有遺傳穩(wěn)定性的個體。

　　2.2遴選程序

　　2.2.1G0代生長發(fā)育、繁殖性能和生理生化指標的測定和評價對所有G0代個體按家畜育種的常規(guī)進行飼養(yǎng)管理(有些種類的轉基因家畜也許需要特殊的飼養(yǎng)管理)并觀測其生長發(fā)育和繁殖性能，在規(guī)定的日齡進行生理生化指標的檢測，重點觀察有無異?；蚱渌牟±肀憩F。所有測定和檢測，均應以同窩非轉基因家畜或親本品種的成績作為對照。

　　2.2.2G0代轉基因家畜的表達檢測對生長發(fā)育、繁殖性能和生理生化指標正常的G0代轉基因家畜，進行轉基因的表達檢測。表達檢測的程序，應首先進行轉錄(mRNA)水平的檢測，然后進行翻譯水平(蛋白質水平)的定性和定量檢測，有些還要進行生物活性的檢測、功能測試和性能測定。從而選擇出達到預期表達水平的G0代轉基因個體。

　　2.2.3G0代個體遺傳穩(wěn)定性測定測定G0代轉基因個體的遺傳穩(wěn)定性，需進行繁殖傳代，從后代的檢測情況進行判斷。

　　對于隨機整合的轉基因個體，繁殖傳代應采取如下方式：雄性G0代個體應與非轉基因的雌性個體進行交配，雌性G0代轉基因個體應與非轉基因雄性個體交配。按照這樣的交配方式，從理論上，遺傳穩(wěn)定的G0代個體，其后代的陽性率應為50%。實際操作中，在后代個體數不少于30個樣本的情況下，接近50%即可，樣本量越大，越應接近50%。切忌G0代不同性別個體之間的交配，因為每頭G0代個體整合的位點不一，表達水平不同，同時還存在轉基因嵌合體的可能，這種交配方式所產生后代的檢測結果無法說明任何一個親本的遺傳性。

　　對于定位整合技術制備的G0代轉基因個體，應首先進行外源基因的定位檢測，以判斷其是否按照預期整合到相應的位點上;同時進行表達檢測，定位整合的G0代個體其表達水平應該是基本一致的，但允許有一定的差別(同位點、相同拷貝數的整合，由于個體之間的差異，也會出現表達水平的差別)。即使整合與表達的檢測都達到了預期的G0代個體，也必須通過傳代來判斷其是否具有遺傳的穩(wěn)定性。其繁殖傳代的方式可有兩種：一種方式如前所述，即G0代轉基因個體與非轉基因個體進行交配，如后代的陽性率50%左右，且G1的表達水平基本達到了轉基因親本的水平，即可初步認為該G0代轉基因個體具有遺傳穩(wěn)定性;另一種方式，即兩頭具有不同性別的G0代個體之間的交配，其產生的子代(G1)如果陽性率為75%左右，就可以初步認為該兩頭G0代個體均具有遺傳穩(wěn)定性。

　　最終判定G0代轉基因個體的遺傳是否穩(wěn)定，還有賴于由該G0代所產生的G1、G2，甚至于G3、G4代的檢測結果。

　　3轉基因家畜純合體的建立

　　建立轉基因家畜的純合體(或純合子)可有兩條路線：一是利用遴選出的具有遺傳穩(wěn)定性的G0代個體，通過常規(guī)繁育獲得;二是利用體細胞二次基因打靶，獲得雙等位基因整合(或敲除)的家畜。第一條路線耗時長，而且還有近交風險;第二條路線可一步到位，但技術難度大。

　　3.1通過常規(guī)繁育建立轉基因純合體

　　3.1.1隨機整合轉基因純合體的獲得隨機整合的情況下，G0代個體之間整合的位點不一，整合的拷貝數不同，表達水平也有差別。如果不同性別的G0代個體之間進行交配，無法得到雙等位基因整合的后代，因此也就不能得到轉基因純合體。只有G0代個體與非轉基因個體交配所產生的G1代，其整合的位點、整合的拷貝數和表達水平才會是一致的;進而進行G1代之間的交配，在近交所產生的G2代中，才能篩選出轉基因純合體。其近交的方式可有如下兩種。

　　全同胞近交：交配模式如圖1所示。

　　在圖1的交配模式中，G2代轉基因個體的比例應為總產仔數的75%;而在G2代轉基因個體中，純合體應占1/3。

　　半同胞近交：除個別作為試驗動物用的動物外，作為商業(yè)生產的家畜品種，并沒有嚴格生物學意義上的近交系。非近交系的家畜實行近交，會出現近交衰退的現象。近交的程度越高，近交衰退的現象也就越嚴重。為了降低近交衰退的風險，可采用半同胞近交，交配模式如圖2所示。圖2的交配模式，G2代轉基因個體中純合體亦應占1/3。

　　3.1.2定位整合轉基因純合體的獲得應用定位整合技術所獲得的G0代轉基因個體之間，由于其整合位點、整合拷貝數相同，表達水平也基本一致，因此可以直接用不同性別相互交配的方法得到純合體。如圖3所示。在圖3的交配模式中，G1代轉基因個體的比例應占總產仔數的75%，而純合體應占G1代轉基因個體的1/3。

　　3.1.3轉基因純合體的鑒定與篩選上述無論哪一種交配模式，都需要將純合體從轉基因的群體中篩選出來。鑒定純合體的方法有兩種：第一種是實驗室方法，近年來發(fā)展建立了一些純合體轉基因動物鑒定的實驗室方法，如熒光原位雜交法(FISH)、Southern雜交法和熒光實時定量PCR法等。這些方法已成功地應用于轉基因小鼠純合體的篩選。第二種是常規(guī)繁育法，實驗室方法的檢測結果只能作為參考，最終確認純合體還必須通過常規(guī)繁育的方法。轉基因個體與非轉基因個體交配，如果其后代100%是轉基因的，就可以確認該轉基因親本是純合體;否則其轉基因親本仍然是“雜合子”。

　　3.2通過基因重復打靶技術建立轉基因家畜純合體

　　通過常規(guī)繁育技術建立轉基因家畜純合體耗時很長。以豬為例：豬的世代間隔為1年左右，如前所述，隨機整合的G0代轉基因豬通過兩個世代的繁育，加上鑒定純合體的一個世代，至少需要3年的時間才能最終篩選出純合體;即使是定位整合的G0代轉基因豬，至少也需要2年的時間才能最終篩選出純合體。對于牛等世代間隔長的家畜，其所耗費的時間就更長。體細胞的基因重復打靶技術為解決上述問題提供了可以一次到位的技術路線。Kuroiwa等[10]對牛成纖維細胞進行PRNP基因的打靶，并通過克隆技術構建重構胚，重構胚移植到子宮內發(fā)育成75日齡的胎兒實施流產并再次分離其成纖維細胞;然后進行重復打靶獲得純合型基因敲除細胞，以純合型基因敲除細胞作為核供體，構建成PRNP雙等位基因位點失活的轉基因牛。

　　體細胞基因重復打靶的關鍵技術有兩點：一是要利用目標基因及其相鄰序列，構建A和B兩種基因打靶載體，分別用于敲除兩條姊妹染色體上的目標基因拷貝;A、B兩種載體分別用不同的標記，如GFP和RFP，防止兩種標記基因相互干擾。二是要建立“細胞拯救技術”。在體細胞上實施基因打靶的制約因素，是細胞壽命太短。由于細胞增殖的代數有限，往往是尚未確定是否實現了靶向基因交換，細胞就進入凋亡期，難以把細胞還原成動物個體。但是，體細胞經過核移植過程之后，可以重新啟動發(fā)育程序，其壽命得到更新。根據這個原理，在兩輪基因打靶之間引入細胞拯救過程，使第一輪基因打靶中的陽性細胞得以更新。這一技術步驟能將細胞團擴增為胎兒組織，生產大量均質的細胞，這些細胞不僅可以滿足進一步分子檢測需要，同時為完成第二輪基因打靶爭取到足夠的時間。

　　完成兩次基因打靶核移植出生的后代，應該全部是雙等位基因整合(或敲除)的純合體。但最終的確認還是要通過實驗室檢測和常規(guī)繁育的方法，轉基因個體與非轉基因個體交配，如果其后代100%是轉基因的，就可以確認該轉基因親本是純合體。

　　4轉基因家畜新品種的建立

　　得到遺傳穩(wěn)定的轉基因純合體家畜后的工作便是進入常規(guī)育種的程序。為了監(jiān)測外源基因在進入常規(guī)育種傳代過程中是否丟失或變異，需要對后代逐頭進行分子檢測。

　　4.1轉基因新品系的建立

　　建立轉基因新品系，可采用系祖建系法，即以經過篩選的純合體為系祖建立品系。以豬為例：豬的品系群最低應不少于6個血統(tǒng)的6頭公豬和30～40頭母豬所組成[11]，形成這樣的一個遺傳穩(wěn)定、表達水平基本一致的群體，就可以認為轉基因豬新品系建立成功。

　　4.1.1隨機整合轉基因家畜新品系的建立隨機整合的轉基因家畜個體之間，外源基因整合的位點和拷貝數不一致，如果用來源不同(G0代不是同一個體)的純合體之間交配，所得到的后代又成為新的雜合體。因此，只能采用同一來源(G0代為同一個體)的純合體之間交配，才能保證后代的純合性和遺傳穩(wěn)定性。這就增加了建系的難度，過高的近交系數會導致群體的衰退，生命力下降，有的或許難以為續(xù)。因此，在建立純合體的過程中，一是要盡可能采用半同胞近交的方式;二是選擇的非轉基因個體與G0代轉基因個體之間，以及非轉基因個體之間，應盡量避開血緣關系。

　　以來源于同一頭G0代轉基因家畜的若干純合體(G2代)，經各種性狀的選擇之后，首先建立若干個家系。在建立家系的過程中，設計公、母畜之間的交配組合，也要盡量降低近交系數。在建立家系的基礎上，按育種計劃的數量，選擇其中優(yōu)秀的公、母畜個體，進行純繁擴群，建立核心群，進而形成品系。

　　4.1.2定位整合轉基因家畜新品系的建立應用定位整合技術制備的轉基因家畜，其新品系的建立比隨機整合要簡單、易行。無論來源是否相同(G0代是否為同一個體)的純合體，其交配的后代都是純合體。這就可以容易地避開血緣關系，降低或防止近交衰退。

　　如果是應用重復打靶技術獲得的純合體轉基因家畜，從G0代就可以進行選擇并建立家系的工作。

　　從不同整合類型轉基因家畜新品系建立的過程中，可見定位整合乃至于雙等位基因整合對于轉基因育種的重要性;同時啟示我們，如果出于育種的目的制備轉基因家畜，從一開始就應考慮后期育種工作的復雜性，從而選擇合適的轉基因技術路線。

　　4.2轉基因新品種的建立

　　我國豬育種工作者認為，一個豬的品種，至少應有3個以上的品系。每個品系之間應有不同的品質[11]。對于轉基因豬的所有品系而言，轉基因所表達性狀的品質應該是共同具備的。而品系之間品質的不同，則可以從以下幾方面體現：①以制備轉基因豬時所用不同親本的品系為基礎，建立若干個轉基因品系;②以轉基因性狀表達水平的差異，建立若干個品系。③隨著轉基因品系擴繁規(guī)模的擴大，會逐步分布在不同的地區(qū)和不同的飼養(yǎng)場。不同的地區(qū)或不同的飼養(yǎng)場，其飼料結構、自然條件、飼養(yǎng)管理方法的不同，會形成若干各具特點、互有差別(這些特點或差別應主要體現在常規(guī)性狀上)的類群，從而形成若干新的品系。

　　至今尚未見任何一種轉基因家畜新品種培育成功的報道，其過程也許比本研究描述的這些要復雜、困難得多，會有許多現在還預料不到的事情發(fā)生。只有在今后的育種實踐中，不斷探索、總結和完善，形成轉基因家畜育種的新的理論和方法。

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