脆性X智力低下基因有什么研究
檢測脆性X染色體綜合征智力低下基因FMR1中(CGG)n拷貝數(shù)的多態(tài)性。下面小編為你整理脆性X智力低下基因FMR1中不穩(wěn)定DNA序列的研究，希望能幫到你。
【摘要】 目的 檢測脆性X染色體綜合征智力低下基因FMR1中(CGG)n拷貝數(shù)的多態(tài)性。 方法 采用PCR結(jié)合序列膠銀染法、Southern blot雜交分析法，對299條表型正常的湖南省人群X染色體FRAXA位點(diǎn)(CGG)n拷貝數(shù)的多態(tài)性及分布頻率進(jìn)行了測定和驗(yàn)證。 結(jié)果 顯示其范圍為20～40，高峰為28，PCR-序列分析銀染法結(jié)果與Southern blot法結(jié)果完全一致。 結(jié)論 檢測了湖南省人群X染色體FRAXA位點(diǎn)(CGG)n拷貝數(shù)的多態(tài)性;運(yùn)用PCR-序列分析膠銀染法快速、直接、簡便、實(shí)用，適合脆性X綜合征的大規(guī)模群體篩查。
【關(guān)鍵詞】 脆性X綜合征 FMR1 (CGG)n PCR
脆性X綜合征(fragile X syndrome，F(xiàn)raX)是常見的遺傳性智力低下性疾病之一，其發(fā)病率僅次于唐氏綜合征。在人群中男性的發(fā)病率約為1/4000 [1] ，女性的發(fā)病率為1/2500 [2] 。其在細(xì)胞學(xué)上主要表現(xiàn)為Xq27.3帶處有一細(xì)絲樣的脆性位點(diǎn)(FRAXA) [3] ，在分子水平上表現(xiàn)為FMR1基因5'端(CGG)n的異常擴(kuò)增。(CGG)n在正常人群體中呈多態(tài)性，n=6-50，當(dāng)n=50-200時(shí)為前突變，n>200時(shí)為全突變，同時(shí)伴隨其周圍CpG島異常甲基化 [4] 。我們根據(jù)FraX基因致病特點(diǎn)，通過測定湖南省人群中CGG重復(fù)序列，了解其分布的多態(tài)性，并建立一個(gè)簡便、快捷的基因檢測方法。
1 材料和方法
1.1 研究對象及標(biāo)本 208名人群為本校附屬醫(yī)院門診自愿受檢者，男117名，女91名，年齡24～56歲，平均36.5歲。分別從肘靜脈抽取血1～2ml，以草酸鉀抗凝，標(biāo)本按碘化鉀法提取DNA。
1.2 主要試劑 T 4 多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaza-dGTP等均為NEB公司產(chǎn)品，雜交液、尼龍膜、PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑均購自上海生工，探針PE5.1由美國紐約州立發(fā)育不全基礎(chǔ)研究所Nanbert Zhong博士惠贈(zèng)。
1.3 PCR擴(kuò)增 PCR引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn) [5] ，在FMR1基因內(nèi)(CGG)n重復(fù)區(qū)域兩側(cè)合成引物。其中上游引物為:5'-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3'，下游引物為:5'-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG-3'。反應(yīng)體積為20μl，其中包括10×PCR緩沖液，50～100ng模板，每種引物5pmol，200μmol/LdNTP，其中dGTP中75%為7-deaza-dGTP，10%DMSO，1UTaq DNA聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min，95℃1min，65℃1min，72℃2min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
1.4 PCR產(chǎn)物的序列膠銀染法檢測 取10μl PCR產(chǎn)物加入載樣緩沖液于6%序列膠電泳。電泳畢經(jīng)乙酸固定、Ag-NO3溶液染色及Na 2 CO 3 顯示后觀察結(jié)果。
1.5 Southern印跡雜交 取5μl PCR產(chǎn)物于6%序列膠電泳，常規(guī)電轉(zhuǎn)膜，用5′末端標(biāo)記法以γ- 32 P-ATP標(biāo)記探針PE5.1，經(jīng)預(yù)雜交4h，雜交2h，充分洗膜后常規(guī)壓片，-70℃放射自顯影。
2 結(jié)果
2.1 湖南省人群中FRAXA位點(diǎn)(CGG)n的多態(tài)性及分布頻率用PCR方法分析了299條X染色體。經(jīng)序列膠測定(圖2)，Southern印跡雜交法驗(yàn)證(圖3)，表明(CGG)n的拷貝數(shù)在20～40之間(見表1)，頻率最高的為28(圖1)。
表1 湖南省人群中299條X染色體的CGG重復(fù)數(shù) CGG重復(fù)數(shù) 等位基因數(shù) 構(gòu)成比(略)
圖1 299條X染色體的(CGG) n 多態(tài)性分布圖 2.2 6%序列膠電泳檢測PCR產(chǎn)物 見圖2。
2.3 Southern blot檢測PCR產(chǎn)物 Southern印跡雜交結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)帶所在位置與圖2完全一致(見圖3)。
3 討論
3.1 湖南省人群中FRAXA位點(diǎn)(CGG)n的多態(tài)性 299條M:PBR322/MSPI;1，2，3，4，5，6分別表示CGG重復(fù)數(shù)為28，28，31，28，28，29第1，6道為正常女性，第2，3，4，5道為正常 男性(下同)。
圖2 6%序列膠電泳
圖3 Southern印跡雜交
表型正常的湖南省人群X染色體FRAXA位點(diǎn)(CGG)n測定結(jié)果顯示，其拷貝數(shù)范圍為20～40，高峰為28，占被檢總數(shù)的64.88%。Hofstee [6] 等報(bào)道的(CGG)n峰值為28，Jacobs [7] 等研究發(fā)現(xiàn)有2個(gè)高峰，即:19～23和28～31。本文結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符，但未見到明顯的終端重復(fù)數(shù)，說明選取樣本有限。
3.2 PCR-序列分析膠銀染法的運(yùn)用 目前已有多種篩查及診斷FraX的方法，但不同方法各有其局限性。如細(xì)胞遺傳學(xué)分析雖可以直接觀察染色體脆性位點(diǎn)的病變，但此方法檢出率較低;DNA連鎖分析較細(xì)胞遺傳學(xué)分析增加了可信度，但該技術(shù)需要有先證者，致使檢測受到一定程度的限制;經(jīng)典的Southern blot法雖然準(zhǔn)確性很高，但需要用同位素來標(biāo)記，給操作者帶來了一定的危害，并且操作繁雜，費(fèi)用昂貴，耗時(shí)長;常規(guī)的PCR法雖簡便，但因無法打開CG含量高的DNA模板導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。因此，探索出一個(gè)穩(wěn)定、快速、適合大規(guī)模人群篩查FraX的方法具有重要的意義。我們通過用7-deaza-dGTP代替dGTP的改良以降低Tm值，對299條X染色體的FRAXA位點(diǎn)(CGG)n進(jìn)行了擴(kuò)增，取得了較好的效果。檢測結(jié)果顯示湖南省人群的高峰為28，而且PCR序列膠銀染法與PCR-Southern blot法結(jié)果完全一致。因此。該方法對FRAXA的大量群體篩查具有重要的意義。
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