選修一生物技術實踐知識點梳理(2)
選修一生物技術實踐知識點梳理
專題二 微生物的培養(yǎng)與應用
課題一 微生物的實驗室培養(yǎng)
·培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質，是進行微生物培養(yǎng)的物質基礎。
·培養(yǎng)基按照物理性質可分為液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂(是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑)后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養(yǎng)基應用于工業(yè)或生活生產，固體培養(yǎng)基應用于微生物的分離和鑒定，半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等。
·按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學物質配制而成，其中成分的種類比例明確，常用于微生物的分離鑒定。天然培養(yǎng)基是用化學成分不明的天然物質配制而成，常用于實際工業(yè)生產。
·按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物生長，促進所需要的微生物的生長。鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成的，用以鑒別不同類別的微生物。
·培養(yǎng)基的化學成分包括 水 、 無機鹽 、 碳源 、 氮源 (生長因子)等。
·碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質。如CO2、NaHCO3等無機碳源;糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。單質碳不能作為碳源。
·氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質。如N2、NH3、NO3-、NH4+(無機氮源)蛋白質、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨(有機氮源)等。只有固氮微生物才能利用N2。
·培養(yǎng)基還要滿足微生物生長對PH、特殊營養(yǎng)物質以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時須將培養(yǎng)基的pH調至酸性，培養(yǎng)細菌是需要將pH調至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無氧的條件
·無菌技術·獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：
①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。
?、趯⒂糜谖⑸锱囵B(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。
③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。
?、軐嶒灢僮鲿r應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。
無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的?
答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。
·消毒與滅菌的區(qū)別
消毒指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法(對于一些不耐高溫的液體)還有化學藥劑(如酒精、氯氣、石炭酸等)消毒、紫外線消毒。
滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。
滅菌方法：
?、俳臃N環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法;
?、诓Ａ髅蟆⒔饘儆镁叩仁褂酶蔁釡缇?，所用器械是干熱滅菌箱 ;
?、叟囵B(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋 。
④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈 。
(1)方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板?！ ≈谱髋Ｈ飧嗟鞍纂斯腆w培養(yǎng)基
(2)倒平板操作的步驟：
?、賹邕^菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。
②右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過火焰。
?、塾米笫值哪粗负褪持笇⑴囵B(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10～20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。
?、艿却桨謇鋮s凝固，大約需5～10min。然后，將平板倒過來放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上。
·倒平板操作的討論
1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度?
提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。
2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰?
答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。
3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置?
答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，將平板倒置，既可以防止培養(yǎng)基表面的水分過度地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。
4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎?為什么?
答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。
純化大腸桿菌
(1)微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。
(2)平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落。
(3)稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。
(4)用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。
(5)平板劃線法操作步驟：
?、賹⒔臃N環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞。
?、蹖⒃嚬芸谕ㄟ^火焰。④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。
⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。⑥左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)皿。⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區(qū)域內劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
·平板劃線操作的討論
1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)?在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎?為什么?
答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物;每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。
2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線?
答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。
3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線?
答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。
(6)涂布平板操作的步驟：
?、賹⑼坎计鹘谑⒂芯凭臒?。②取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。
?、蹖⒄从猩倭烤凭耐坎计髟诨鹧嫔弦迹凭急M后，冷卻8～10s。
?、苡猛坎计鲗⒕壕鶆虻赝坎荚谂囵B(yǎng)基表面。
涂布平板操作的討論
涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作?
提示：應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍;等等。
菌種的保存
(1)對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。
①臨時保藏方法
將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當菌落長成后，將試管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6個月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉移到新鮮的培養(yǎng)基上。
②缺點：這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產生變異。
(2)對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。
在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在-20℃的冷凍箱中保存。
疑難解答
(1)生物的營養(yǎng)
營養(yǎng)是指生物攝取、利用營養(yǎng)物質的過程。營養(yǎng)物質是指維持機體生命活動，保證發(fā)育、生殖所需的外源物質。
人及動物的營養(yǎng)物質：水、無機鹽、糖類、脂質、蛋白質、維生素六類。
植物的營養(yǎng)物質：礦質元素、水、二氧化碳等三類。
微生物的營養(yǎng)物質：水、無機鹽、碳源、氮源及特殊營養(yǎng)物質五類。
(2)確定培養(yǎng)基制作是否合格的方法
將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2天，無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。
課題二 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)
尿素 是一種重要的農業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農作物吸收。只有當土壤中的細菌將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為他們能合成脲酶
尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的
篩選菌株
(1)實驗室中微生物的篩選應用的原理
人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。
(2)選擇性培養(yǎng)基
在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。
(3)配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)
根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點加入某種物質以達到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基中不加入有機物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物;培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物;加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。
統(tǒng)計菌落數(shù)目
(1)測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)。
(2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理
當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結果準確，一般設置3～5個平板，選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)，并取平均值。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，因此，統(tǒng)計結果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。
采用此方法的注意事項：1.一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進行計數(shù)
2.為了防止菌落蔓延，影響計數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入TTC(在計數(shù)瓊脂中加入適量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML瓊脂中),細菌菌落長成紅顏色,對去除食品本底顆粒物干擾非常有意義).
3.本法僅限于形成菌落的微生物
設置對照
設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照試驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應的結果。
實驗設計
實驗設計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。
(1)土壤取樣：同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類最多。在富含有機質的土壤表層，有更多的微生物生長。從富含有機物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約3～8cm的土壤層取樣。
(2)樣品的稀釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30~300之間、適于計數(shù)的平板。
測定土壤中細菌的數(shù)量，一般選用104 105 106
測定放線菌的數(shù)量，一般選用103 104 105
測定真菌的數(shù)量，一般選用102 103 104
(3)微生物的培養(yǎng)與觀察
不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌30~37℃ 1~2天
放線菌25~28℃ 5~7天 霉菌25~28℃ 3~4天
每隔24小時統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導致一樓菌落的數(shù)目。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。形狀、大小、隆起程度、顏色
疑難解答
(1)如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)?
統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值
每克樣品中的菌落數(shù)=(C/V)*M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)
課題三 分解纖維素的微生物的分離
纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質。
纖維素與纖維素酶
(1)棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。
(2)纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養(yǎng)。
纖維素分解菌的篩選
(1)篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顏色反應直接對微生物進行篩選。
(2)剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理
剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。
分離分解纖維素的微生物的實驗流程
土壤取樣→選擇培養(yǎng)(此步是否需要，應根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定)→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產生透明圈的菌落
(1)土壤采集 選擇富含纖維素的環(huán)境。
(2)剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟 倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板
(3)剛果紅染色法種類
一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。
課題延伸
對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選后，只是分離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產生的葡萄糖進行定量的測定。
疑難解答
(1)為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌?
由于生物與環(huán)境的相互依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。
(2)將濾紙埋在土壤中有什么作用?你認為濾紙應該埋進土壤多深?
將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。
(3)兩種剛果紅染色法的比較
方法一是傳統(tǒng)的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜;其優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質，可以使能夠產生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應。但這種只產生淀粉酶的微生物產生的透明圈較為模糊，因為培養(yǎng)基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產生的透明圈相區(qū)分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。
(4)為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物?
在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。