免疫熒光技術(shù)論文(2)
免疫熒光技術(shù)論文
免疫熒光技術(shù)論文篇二
免疫熒光雙標記技術(shù)檢測胎盤HBsAg┐抗┐HBs復(fù)合物
作者：王歆 ，徐德忠 ，劉蓬勃 ，李玉松 ，王素萍
【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒
關(guān)鍵詞: 肝炎病毒，乙型;胎盤;抗原抗體復(fù)合物
摘 要:目的 探討乙肝病毒(HBV)以何種形式感染胎盤滋養(yǎng)層細胞. 方法 通過免疫熒光雙標記技術(shù)檢測12例血清HBsAg陽性母親的胎盤滋養(yǎng)層細胞HBsAg-抗-HBs復(fù)合物. 結(jié)果 血清學(xué)HBsAg陽性母親胎盤滋養(yǎng)層細胞中存在HB-sAg-抗-HBs復(fù)合物. 結(jié)論 提示HBV可能通過HBsAg與抗-HBs結(jié)合成復(fù)合物的方式進入胞內(nèi)，導(dǎo)致胎盤屏障的第一層細胞受到HBV感染.
Keywords:hepatitis B virus;placenta;antigen-antibody complex
Abstract:AIM To find out which form Hepatitis B Virus(HBV)takes in the infection of the first layer cell of placenta barrier-trophoblast cells.METHODS HBsAg-anti-HBs complexes in HBsAg seropositive maternal placenta tissues were tested by double-labeling immunofluorenscence method visualized with laser scanning confocal microscope.RESULTS HBsAg-anti-HBs complexes were found mainly on tro-phoblast cells(TC)of HBsAg seropositive maternal placenta tissues.CONCLUSION HBsAg and anti-HBs are formed as HBsAg-anti-HBs complexes before entry into trophoblast
cells，which may result in the infection of the first layer cell of placenta barrier.
0 引言
乙型病毒肝炎是嚴重危害我國人民健康的傳染病.乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性的孕婦可將乙肝病毒(HBV)經(jīng)胎盤傳給胎兒，這種傳播稱為HBV的宮內(nèi)傳播.現(xiàn)在普遍認為，胎盤在HBV宮內(nèi)感染中起重要作用，認為HBV是先感染胎盤然后才引起胎兒感染的，我室既往用免疫組織化學(xué)和原位雜交方法對101例血清學(xué)HBsAg陽性胎盤組織檢測了HB-sAg和HBVDNA，其中滋養(yǎng)層細胞HBsAg陽性率為40.6%(41/101)，發(fā)現(xiàn)HBsAg主要分布于胞質(zhì)[1] .國外學(xué)者在3例HBsAg慢性攜帶者胎盤絨毛基質(zhì)血管內(nèi)、滋養(yǎng)層細胞等檢測到HBsAg[2] .可見胎盤滋養(yǎng)層細胞受到HBV感染已毋庸置疑，但HBV是如何進入滋養(yǎng)層細胞的確切機制國內(nèi)外尚未見報導(dǎo).本研究通過對胎盤組織HBsAg-抗-HBs復(fù)合物的檢測，試圖闡明HBV是以何種方式跨越胎盤屏障進入滋養(yǎng)層細胞，為進一步揭示其宮內(nèi)傳播機制提供依據(jù).
1 材料和方法
1.1 材料
1997/1998年太原市傳染病院婦產(chǎn)科收集HBsAg陽性足月分娩產(chǎn)婦靜脈血3～5mL及胎盤組織，靜脈血分離血清后貯存于-20℃冰箱，統(tǒng)一進行HBsAg，HBsAg復(fù)查.用手術(shù)刀切取約1.5cm×1cm×2cm大小的胎盤組織(包括母面及胎兒面)浸入40g・L-1 多聚甲醛中固定后常規(guī)石蠟包埋.從以上收集的胎盤標本中選擇ABC和免疫熒光組織化學(xué)檢測為HBsAg陽性的胎盤標本12例.鼠抗-HBs購于武漢博士德生物工程有限公司(BioGenex產(chǎn)品，克隆號:A34060259P，Cat.No:MU364-UC);FITC標記的HBsAg自制(HBsAg購于北京醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，從HBsAg攜帶者血漿中提取，經(jīng)濃縮后，用FITC進行標記);生物素化兔抗鼠IgG購于博士德，產(chǎn)品編號:SA1072，Avidin標記的Texas Red購于基因公司(Molecular Probes產(chǎn)品，Catalog No:A-2665).用正常鼠血清代替鼠抗-HBs及FITC標記的HBsAg作為抗體特異性對照;用PBS代替抗-HBs及FITC標記的HBsAg作為空白對照;另外用血清學(xué)檢查HBV感染標記全陰性胎盤組織作為正常陰性對照.
1.2 方法
1.2.1 HBsAg的檢測
切片常規(guī)脫蠟(二甲苯、梯度乙醇)水化后，加入1∶50稀釋的鼠抗-HBs單抗，4℃過夜.PBS振洗后，再加入1:50稀釋的生物素化的兔抗鼠IgG37℃60min，最后加入1∶1000稀釋的Avidin標記的Texas Red，37℃孵育數(shù)小時，PBS充分洗滌，用無熒光緩沖甘油封片后，直接在激光共聚焦顯微鏡(LSCM)上觀察并拍照.所用LSCM型號為Bio-RadMRC-1024，用于Taxas Red的激發(fā)波長為568nm.
1.2.2 抗-HBs的檢測
切片同上脫蠟水化后，加入1∶20稀釋的FITC標記的HBsAg.37℃孵育數(shù)小時，PBS充分洗滌，激光共聚焦顯微鏡(LSCM)上觀察并拍照，用于FITC的激發(fā)波長為488nm.
1.2.3 HBsAg-抗-HBs復(fù)合物的檢測
切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，加入3mol・L-1 尿素，室溫30min后，滴加1∶50/PBS正常血清封閉液，室溫10min.滴加1∶50稀釋鼠抗-HBs，4℃過夜.PBS振洗后，再加入1∶50稀釋的生物素化的兔抗鼠IgG37℃60min，最后加入1∶1000稀釋的Avidin標記的Texas Red和1∶20稀釋的FITC標記的HBsAg.37℃孵育數(shù)小時，PBS充分洗滌，用無熒光緩沖甘油封片后，直接在激光共聚焦顯微鏡(LSCM)上觀察并拍照.
2 結(jié)果
對血清學(xué)HBsAg陽性胎盤組織采用免疫熒光間接法檢測HBsAg，并在激光共聚焦顯微鏡上進行觀察.紅色熒光代表被檢測的HBsAg陽性.采用免疫熒光直接法檢測其抗-HBs，綠色熒光代表抗-HBs陽性.采用免疫熒光雙標記技術(shù)檢測HBsAg-抗-HBs復(fù)合物，除紅、綠色熒光外，黃色熒光是HBsAg和抗-HBs的重疊色，即二者在同一位置，說明HB-sAg和抗-HBs是以復(fù)合物的形式存在.觀察發(fā)現(xiàn)胎盤滋養(yǎng)層細胞HBsAg(Fig1)、抗-HBs(Fig2)、及HBsAg-抗-HBs復(fù)合物陽性(Fig3～5)，陽性物質(zhì)位于細胞質(zhì).HBV感染標志全陰性胎盤作為正常陰性對照，未顯示陽性染色信號，空白及替代對照也未顯示陽性染色信號.
3 討論
胎盤是胎兒生長和發(fā)育的基礎(chǔ)，是胎兒與母體之間物質(zhì)交換的場所，同時對病原微生物又具有屏障作用.我們近年來將分子流行病學(xué)研究引入HBV宮內(nèi)感染的研究，用免疫組化和原位雜交方法檢測血清HBsAg陽性產(chǎn)婦胎盤細胞HBcAg和HBVDNA，發(fā)現(xiàn)胎盤各層細胞均存在HBV感染，而且從母面的蛻膜細胞到胎兒面的毛細血管內(nèi)皮細胞HBV感染率有逐漸下降的趨勢，HBsAg、HBcAg和HBVDNA主要分布于胎盤細胞的胞質(zhì)，偶見胞核和胞膜[1] .重復(fù)研究得到了相似的結(jié)論.結(jié)合國外的研究結(jié)果 [2] ，血清HBsAg陽性胎盤存在HBV感染已毋庸質(zhì)疑.那么，HBV又是以何種形式感染胎盤細胞并存在于胎盤組織的呢?
我們曾用直接免疫熒光組織化學(xué)法對ABC法檢測為HBsAg陽性的胎盤組織和HBV血清學(xué)感染標志全陰性胎盤檢測抗-HBs，發(fā)現(xiàn)抗-HBs陽性部位分布于絨毛滋養(yǎng)層和絨毛間質(zhì)和蛻膜細胞，與以上檢測的HBsAg的分布相一致，推測HBsAg與抗-HBs很可能是以免疫復(fù)合物的形式沉積于這些細胞.
近年來在許多病毒對人體感染的作用機制研究中，發(fā)現(xiàn)了一種抗體依賴的病毒感染的增強作用，即非中和性抗體介導(dǎo)的病毒感染增強作用[3] .有兩種形式:一種是病毒與IgG抗體結(jié)合成復(fù)合物，經(jīng)細胞表面的Fc受體介導(dǎo)，以內(nèi)化方式進入胞內(nèi);另一種是包被了IgM抗體的病毒與補體受體結(jié)合，進而增加病毒對靶細胞的感染.無論何種方式，病毒感染靶細胞都是以抗原-抗體復(fù)合物的形式，那么，乙肝病毒會不會也以此種方式感染胎盤細胞呢?
HBV進入人體后，可產(chǎn)生一系列針對病毒抗原成分的抗體，其中IgG型占大多數(shù).這些抗體與人血液中HBV的不同抗原相結(jié)合，形成多種抗原-抗體免疫復(fù)合物，并可進一步活化補體.HBsAg-抗-HBs復(fù)合物就是其中的一種.研究發(fā)現(xiàn)，急性或慢性HBV感染患者體內(nèi)，HBsAg-抗-HBs復(fù)合物中抗-HBs的主要亞型是IgG1和IgG4，而恢復(fù)期患者血清中游離抗-HBs主要亞型是IgG1和IgG3
[4] .胎盤絨毛間隙充滿母體血，絨毛滋養(yǎng)層細胞浸浴在HBV感染的母體血液中，從理論上講，為HBsAg-抗-HBs復(fù)合物沉積于絨毛滋養(yǎng)層細胞提供了條件，也是HBV侵入胎兒的關(guān)鍵部位.
我們應(yīng)用免疫熒光雙標記組織化學(xué)技術(shù)，采用共聚焦顯微鏡觀察方法，檢測血清HBsAg陽性產(chǎn)婦胎盤組織HBsAg-抗-HBs復(fù)合物，HBsAg的檢測用紅色熒光顯示，抗-HBs用綠色熒光顯示，若復(fù)合物存在，應(yīng)呈黃色熒光.結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBsAg和抗-HBs以免疫復(fù)合物形式存在于絨毛滋養(yǎng)層和間質(zhì)細胞，空白對照，替代對照及母親血清HBV感染標志全陰性胎盤未發(fā)現(xiàn)熒光染色，說明所檢測到的HBsAg-抗-HBs復(fù)合物非假陽性結(jié)果.
我們發(fā)現(xiàn)了胎盤在宮內(nèi)傳播中的作用，并提出了HBV宮內(nèi)傳播機制的假設(shè)[5] ，即通過以下兩條途徑:除血源性途徑外，還可通過HBV在胎盤組織內(nèi)的“細胞傳遞”(cell transmission)途徑，即HBV可以從母體蛻膜細胞通過“逐層轉(zhuǎn)移”至胎兒絨毛毛細血管內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致胎兒感染.為探明“細胞傳遞”的具體機制，本次研究采用雙標免疫熒光組織化學(xué)法首先證實了胎盤滋養(yǎng)層細胞表面存在HBsAg-抗-HBs復(fù)合物，因而認為HBV感染滋養(yǎng)層細胞是以HBsAg與抗-HBs結(jié)合成復(fù)合物的形式，為進一步揭示宮內(nèi)傳播機制提供了依據(jù).
致 謝 太原傳染病院婦產(chǎn)科白鋼鉆主任等協(xié)助收集標本;病理教研室李玉松教授在實驗中給予指導(dǎo);電鏡室王春梅主任給予共聚焦技術(shù)上的大力協(xié)助.
參考 文獻:
[1]YanYP，Xu DZ，Wang WL，Liu B，Liu ZH，Men K，Zhang JX，Xu JQ.The role of placenta in Hepatitis B virus intrauter-ine transmission [J].Zhonghua Fuchanke Zazhi(Chin J Obstet Gynecol)，1999;34(7):392-395.
[2]Lucifora G，Calabro S，Carroccio G，Brigandi A.Immunocy-tochemical HBsAg evidence in placents of asmptomatic carrier mothers [J].Am J Obstet Gynecol，1988;159:839-842.
[3]Liu PB.Antibody-dependent enhancement of virus infection [J].Guowai Yixue Bingduxue Fence(Foreign Med Sci:Virol)，2000;27(1):29-32.
[4]Rath S and Devey ME.IgG subclass composition of antibody to HBsAg in circulating immune complexes from patients with hepatitis B infection [J].Clin Exp Immunol，1998;72(1):164-167.
[5]Xu DZ，YAN YP，XU JQ，Wang WL，Men K，ZHang JX，Liu B，Liu ZHH，Wang FSH，Jiang ML，CHen XH.A molecular epidemiology study on risk factors and mechanism of HBV in-trauterine transmission [J].Zhonghua Yixue Zazhi(Natl Med J China)，1999;79(1):24-27.
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