電鏡技術(shù)論文
電鏡技術(shù)論文
電鏡技術(shù)已廣泛用于病毒的形態(tài)特征、分子結(jié)構(gòu)以及與宿主細(xì)胞相互作用的研究，學(xué)習(xí)啦小編為大家整理的電鏡技術(shù)論文，希望你們喜歡。
電鏡技術(shù)論文篇一
電鏡樣品制備技術(shù)的應(yīng)用
【關(guān)鍵詞】 電鏡樣品;制備;咨詢
隨著科技和 經(jīng)濟(jì) 的高速 發(fā)展 ，科研、醫(yī)療及診斷水平快速提高， 電子 顯微鏡在 現(xiàn)代 生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛，研究內(nèi)容越來越豐富，針對性越來越強(qiáng)，加之生物樣品多樣化，對電鏡樣品制備技術(shù)提出了更多更高的要求。為了避免實(shí)驗(yàn)的盲目性，避免因解釋不夠、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備不充分、操作不當(dāng)引起的糾紛，減少實(shí)驗(yàn)的失敗率，務(wù)必要抓好電鏡樣品制備技術(shù)。
1電鏡樣品制備的基本要求
首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，擬定實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，制定出實(shí)驗(yàn)流程，根據(jù)經(jīng)濟(jì)承受能力合理選擇實(shí)驗(yàn)分組和時(shí)相點(diǎn)。其次，正確取材腹腔鏡下賁門食管區(qū)局部解剖的臨床意義很關(guān)鍵：取材固定要快，必須在固定液中及時(shí)修小。固定液由電鏡室提供，不能自己配制(特殊標(biāo)本除外)。標(biāo)本保存在4 ℃冰箱，不得冰凍。樣品處理步驟多而復(fù)雜，耗時(shí)長，所以要預(yù)計(jì)鏡下觀察結(jié)果的時(shí)間，便于安排實(shí)驗(yàn)。
2特殊電鏡樣品的制備方法
針對不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模煌臉?biāo)本取材，尋求不同的電鏡樣品制備方法。作者經(jīng)過長期的實(shí)驗(yàn)反復(fù)摸索，得到許多有應(yīng)用價(jià)值的新技術(shù)、新方法，為有類似課題研究的科研人員的電鏡技術(shù)咨詢提供理論依據(jù)。例如要觀察組織細(xì)胞中的鈣，只有采用鈣離子捕捉法，通過細(xì)胞化學(xué)間接地來進(jìn)行鈣的定位[1]。為了促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)鈣化學(xué)充分反應(yīng)，就如何選擇底物、捕捉劑、如何配制試劑和灌注固定等進(jìn)行摸索，得到有效的、可行的電鏡樣品制備方法，可供 參考 。如果要觀察培養(yǎng)細(xì)胞間連接，建議采用改進(jìn)的薄膜細(xì)胞培養(yǎng)法，優(yōu)勢在于細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保存良好，能保持細(xì)胞間原有的位置關(guān)系，利于反復(fù)切片，解決了單層培養(yǎng)細(xì)胞頂扣包埋后切片難、成功率低的問題[2]。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮物質(zhì)作為懸浮細(xì)胞生長載體是近年組織工程研究的新方法，如何觀察懸浮細(xì)胞生長狀態(tài)的真實(shí)超微結(jié)構(gòu)圖像是電鏡制樣的新課題。改進(jìn)的懸浮細(xì)胞直接沉降法和懸浮物質(zhì)直接移液法，解決了傳統(tǒng)的懸浮細(xì)胞掃描電鏡制樣細(xì)胞和物質(zhì)容易丟失、細(xì)胞表面特殊微細(xì)結(jié)構(gòu)保存不好的問題[3]。電鏡免疫技術(shù)應(yīng)用越來越廣泛，但制樣復(fù)雜，影響因素多，陽性率低。在樣品制備技術(shù)咨詢時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和不同的組織細(xì)胞，不斷查閱 文獻(xiàn) ，共同探討，合理選擇標(biāo)記物、固定液、免疫染色和電子染色等，使免疫電鏡技術(shù)不斷提高，逐步成熟，為科研快速發(fā)展奠定基礎(chǔ)。
3利用電鏡技術(shù)用戶資源提供技術(shù)咨詢
電鏡室是為科研人員服務(wù)的，是設(shè)備和專業(yè)技術(shù)力量較集中的單位。為了提高創(chuàng)新能力，擴(kuò)大交流合作，加強(qiáng)校內(nèi)外信息溝通，與科研人員共同建立了電鏡技術(shù)用戶資源共享平臺，提供相關(guān)的技術(shù)咨詢服務(wù)。建立電鏡技術(shù)用戶資源庫，詳細(xì)記錄了用戶名、實(shí)驗(yàn)日期、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?biāo)本類型、制樣步驟和方法、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、所在單位和聯(lián)系電話等，相關(guān)科研人員只需采取簡單而靈活的電話咨詢或發(fā)郵件等方式進(jìn)行技術(shù)經(jīng)驗(yàn)交流，包括試劑的購買廠家或貴重試劑合用，試劑的配制，實(shí)驗(yàn)流程，標(biāo)本處理方法，實(shí)驗(yàn)操作中的改進(jìn)措施，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析等。實(shí)踐證明，實(shí)驗(yàn)前通過用戶與電鏡專業(yè)技術(shù)人員、用戶與用戶之間的電鏡技術(shù)咨詢，相互借鑒，共同探討，促進(jìn)了科研人員之間的交流與合作，擴(kuò)大了宣傳。實(shí)驗(yàn)成功的技術(shù)方法和理論成果被廣泛推廣應(yīng)用，電鏡技術(shù)不斷被刷新，積累了許多有應(yīng)用價(jià)值的電鏡樣品制備經(jīng)驗(yàn)，豐富了形態(tài)學(xué)研究的內(nèi)容。
科研的成功在于把關(guān)每個(gè)環(huán)節(jié)，對于形態(tài)學(xué)研究要認(rèn)真對待電鏡樣品制備技術(shù)的咨詢，明確方向，擬訂實(shí)驗(yàn)方案，不斷創(chuàng)新并解決技術(shù)難題，才能使超微結(jié)構(gòu)研究取得突破性進(jìn)展，適應(yīng) 現(xiàn)代 醫(yī)學(xué)的 發(fā)展 。
【 參考 文獻(xiàn) 】
[1] 陶忠芬，李文剛，等.大鼠膀胱平滑肌過度充盈后鈣離子分布的變化[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2006，28(6)：608-609.
[2] 趙娟，徐淑梅.一種淀粉樣蛋白電鏡標(biāo)本制備的新方法[J].天津醫(yī)藥，2007，35(4)：287-288.
[3] 路菊,陶忠芬,等.懸浮狀物質(zhì)的樣品制備及掃描電鏡觀察[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007，29(4)：368-369.
電鏡技術(shù)論文篇二
浮游病毒的電鏡觀察
摘要：直接用戊二醛固定水樣中的浮游病毒，通過超速離心使已固定的浮游病毒沉淀到覆有Formvar膜和碳支持膜的銅網(wǎng)上，經(jīng)醋酸雙氧鈾染色后，利用透射電鏡對湖水中的浮游病毒進(jìn)行觀察，結(jié)果可觀察到球形、桿狀和蝌蚪狀等形態(tài)各異的浮游病毒顆粒及球形病毒的囊膜子粒、桿狀病毒的核衣殼、具有不同尾部的蝌蚪狀病毒等的精細(xì)超微結(jié)構(gòu)，從而建立了一種簡便、快捷和高效研究浮游病毒的電鏡方法。
關(guān)鍵詞：電鏡觀察;浮游病毒：超微結(jié)構(gòu)
中圖分類號：Q939.48
文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A
文章編號：1007-7847(2007)01-0048-04
電鏡技術(shù)已廣泛用于病毒的形態(tài)特征、分子結(jié)構(gòu)以及與宿主細(xì)胞相互作用的研究，電鏡觀察可為病毒的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及分類定位提供最直觀的依據(jù)，但要通過電鏡對水樣中的病毒進(jìn)行觀察，通常必須對水樣進(jìn)行濃縮和病毒分離，
浮游病毒是存在于水體中的病毒，浮游病毒也是指水生態(tài)系統(tǒng)中的病毒，目前被普遍認(rèn)為是水體微生物群落中豐富且重要的活性成分，它能調(diào)節(jié)水體中異養(yǎng)細(xì)菌，藍(lán)藻和真核藻類的物種多樣性和生物產(chǎn)量，影響生物地化循環(huán)，介導(dǎo)水生態(tài)系統(tǒng)中微生物之間的基因轉(zhuǎn)換，對水環(huán)境乃至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)都具有重要影響，因此受到人們的廣泛關(guān)注，近些年已有報(bào)道指出，浮游病毒存在不同的形態(tài)類群。
從水樣中分離濃縮病毒，不僅過程繁雜、耗時(shí)長、費(fèi)用高，還會(huì)使水樣中病毒的數(shù)量及完整性受損，可否免去分離濃縮程序，直接對水樣中的浮游病毒進(jìn)行制樣和電鏡觀察呢?因此，本文著重對水樣中浮游病毒樣品的不同制備方法及電鏡觀察效果進(jìn)行比較。
1 材料與方法
1.1 水樣的采集
將取樣器浸入武漢東湖水面以下10cm處取出水樣，裝入收集瓶內(nèi)，立即加入戊二醛(按體積比水樣：戊二醛=9:1，使之終濃度為2.5%)進(jìn)行固定，并迅速將固定后的水樣置于4℃冰箱內(nèi)保存，備用。
1.2 制樣
方法之一：水樣直接滴到銅網(wǎng)上，采用常規(guī)的滴染法，即把水樣直接滴在覆有Formvar膜和碳支持膜的銅網(wǎng)上，使形成一小液珠，放置片刻，用濾紙條吸去多余的液體，自然干燥。
方法之：水樣經(jīng)超速離心到銅網(wǎng)上，參照劉艷鳴等的方法(2005)，以25000r/min離心3h，使病毒沉淀到銅網(wǎng)上，棄去上清，空氣干燥，
1.3 染色
醋酸雙氧鈾染色，在蠟盤中滴加2%的醋酸雙氧鈾，然后將上述干燥好的銅網(wǎng)漂浮在染液上，染色2-3min。
磷鎢酸染色，將2%的磷鎢酸滴加到蠟盤中，將上述干燥好的銅網(wǎng)插入其中，染色2-3min，
1.4 電鏡觀察
在JEM-1230型透射電鏡下觀察，加速電壓為100kV，利用GATAN INC CCD圖像傳輸系統(tǒng)，獲得電鏡圖片。
2 結(jié)果
2.1 制樣方法對觀察效果的影響
我們分別采用了兩種制樣方法和兩種染色方法。結(jié)果顯示：不同的制樣和染色方法對電鏡觀察效果有明顯的影響。
利用方法一所制備的樣品，無論經(jīng)醋酸雙氧鈾染色，還是磷鎢酸染色，都存在雜質(zhì)多，背景暗，而病毒顆粒少的情況，甚至許多視野看不到病毒顆粒，可見，該方法不適宜制備浮游病毒的樣品。
利用方法二所制備的樣品，經(jīng)磷鎢酸染色后，整個(gè)圖像背景雜亂，病毒顆粒分布不均勻，形態(tài)模糊，該方法也無法對水樣中的浮游病毒進(jìn)行準(zhǔn)確觀察。
同樣利用方法二所制備的樣品，經(jīng)醋酸雙氧鈾染色后，可觀察到大量形態(tài)和數(shù)量不同的病毒顆粒，因此該方法可有效用于浮游病毒的形態(tài)觀察及計(jì)數(shù)分析，下述電鏡圖片均是通過該方法得到的。
2.2 浮游病毒的種類、形態(tài)及精細(xì)結(jié)構(gòu)
用方法二所制備的浮游病毒樣品，在透射電鏡下，不僅可清晰地觀察到病毒顆粒的形態(tài)，如球形、桿狀和蝌蚪狀等(圖1)，還能了解其部分精細(xì)結(jié)構(gòu)，包括球形病毒的子粒、桿狀病毒的核衣殼(橫紋狀結(jié)構(gòu))和蝌蚪狀病毒的尾髓等.
2.3 浮游病毒的計(jì)數(shù)分析
在進(jìn)行樣品觀察時(shí)，可以根據(jù)需要來調(diào)節(jié)電鏡的放大倍數(shù)，如要了解病毒的精細(xì)結(jié)構(gòu)時(shí)，可將放大倍數(shù)調(diào)節(jié)到8-10萬倍;如要對水樣中的浮游病毒進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，就將放大倍數(shù)調(diào)低至2萬倍左右，在此條件下，視野較寬，病毒的形態(tài)及數(shù)量都清晰觀察到
3 討論
我們采用了不同的制樣和染色方法，對水體中的浮游病毒進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，常規(guī)的直接滴染法雖然簡便快捷，但由于浮游病毒在水體中的含量與分離或純化后的樣品相比，其量相對較少且分布不均勻，圖像背景雜亂、不清晰，故很難獲得滿意的電鏡圖片，其原因可能是浮游病毒和水中的其它浮游生物、細(xì)胞碎片等固體雜質(zhì)混在一起，吸附到銅網(wǎng)上，對病毒形態(tài)的觀察和圖片拍攝造成干擾。
采用超離法制樣，可得較好的結(jié)果，這是由于在離心力的作用下，一些比病毒顆粒要大的物質(zhì)首先沉降到銅網(wǎng)上，并形成一個(gè)電子密度高且較均勻的背景，為浮游病毒的觀察起托襯作用，值得注意的是，此方法的離心速度較為關(guān)鍵，實(shí)驗(yàn)表明，用25000r/min的轉(zhuǎn)速(Beckman L-90K超速離心機(jī)，SW41轉(zhuǎn)頭)比較適宜，這是由于用過大的離心速度，就會(huì)使有蝌蚪狀病毒的尾巴折斷或損傷;而離心速度過小，則難使體積較小的病毒沉降到銅網(wǎng)上，不能全面真實(shí)地反映待檢水體中浮游病毒的形態(tài)多樣性及含量等情況，另外，每次離心加入待測水量的多少，要根據(jù)水樣中浮游生物、其它懸浮顆粒物的含量以及湖水的富營養(yǎng)化程度等因素來定，在超富營養(yǎng)區(qū)的水樣中，細(xì)菌、藻類等浮游生物及其它懸浮雜質(zhì)較多，每次可加入1mL左右的水樣;而來自富營養(yǎng)區(qū)的水樣，每次加入1.5mL左右;來自中等營養(yǎng)區(qū)的水樣，則要加入2mL左右，這樣才能使離心到銅網(wǎng)上的樣品分布均勻、數(shù)量適中，能獲得較好的觀察效果。
用磷鎢酸對浮游病毒進(jìn)行染色，只產(chǎn)生負(fù)染效應(yīng)，由于它與支持膜的粘附作用很弱，染色后的標(biāo)本不能久留，因此，常難以觀察到浮游病毒的精細(xì)結(jié)構(gòu)，當(dāng)我們選用醋酸雙氧鈾溶液作為染色劑時(shí)，由于醋酸雙氧鈾可產(chǎn)生正染和負(fù)染兩種效果，在銅網(wǎng)中雜質(zhì)多、背景暗的區(qū)域可觀察到淺色的病毒顆粒;在淺色的背景下則可觀察到深色的病毒顆粒，因此，處理得當(dāng)，就能有效觀察到不同背景條件下的浮游病毒顆粒，同時(shí)，醋酸雙氧鈾容易與支持膜粘附，產(chǎn)生較強(qiáng)的反差，染色后的標(biāo)本較穩(wěn)定，有利于保存。
在建立了適宜浮游病毒制樣和染色方法的基礎(chǔ)上，獲得了不同病毒顆粒形態(tài)的圖片、病毒精細(xì)結(jié)構(gòu)的圖片，這顯示所建立的方法，能簡便、有效地用于浮游病毒的研究，包括用于浮游病毒的計(jì)數(shù)分析。
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